Клещевой энцефалит
Клещевой энцефалит сохраняет за собой значение весьма серьезной эпидемиологической, и социальной проблемы отечественного здравоохранения. Это значение определяется огромными размерами нозоареала и чрезвычайно широкими масштабами ежегодного инфицирования вирусом населения в районах с активными природными очагами инфекции (до 35-40% по результатам массовых обследований с помощью РСК). Потенциальная трагичность этого обстоятельства определяется отсутствием эффективных методов лечения и невозможностью предсказать исход заболевания. Стертое и даже бессимптомное начало инфекционного процесса не гарантирует последующего доброкачественного течения. В числе больных с тяжелыми инвалидизирующими остаточными явлениями значительную часть составляют лица, у которых течение инфекции было бессимптомным или очень легким.
Этиология
Возбудитель клещевого энцефалита относится к многочисленным вирусам, экологически связанным с кровососущими членистоногими. За этими агентами закрепилось название арбовирусов; на основе изучения антигенного состава они разбиты на ряд групп, обозначаемых буквами латинского алфавита. Вирус клещевого энцефалита отнесен к группе В; с ее остальными представителями его объединяет наличие общих гемагглютининов. В составе группы этот возбудитель и ряд близких ему видов (вирусы шотландского энцефаломиелита овец, омской геморрагической лихорадки, Киазанурской лесной болезни, Негиши, Повассан, Лангат) образуют самостоятельную антигенную подгруппу. В антигенном строении указанных вирусов проявляются наиболее древние, устойчивые признаки, отражающие происхождение от общего предка и важнейшие черты эволюции этих агентов. В пределах каждого из перечисленных видов пока не удалось доказать существования подвидов, качественно своеобразных в антигенном отношении. В частности первоначальное мнение о существовании самостоятельных возбудителей русского весенне-летнего энцефалита, европейского клещевого (молочного) менингоэнцефалита и двухволнового менингоэнцефалита было пересмотрено после обширных сравнительных исследований. Антигенные различия между ними оказались не выходящими за рамки количественных внутривидовых вариаций.
В отличие от эволюционно древних признаков антигенной структуры, биологические свойства вируса (нейротропизм, висцеротропизм, вирусемическая способность) представляют собой результат более поздних коадаптаций возбудителя и его теплокровных хозяев. Эти свойства гораздо менее стабильны; их количественное выражение довольно широко варьирует в пределах вида и может быть различным у разных штаммов. Одним из важнейших критериев оценки биологических особенностей штаммов вируса является их периферическая активность – способность вызывать поражение ЦНС после экстраневрального заражения лабораторных животных. В пределах одного и того же района могут одновременно циркулировать штаммы как с высокой, так и с низкой периферической активностью. Очевидно, это является одним из проявлений популяционной структуры вируса как биологического вида. Гетерогенность в отношении биологических свойств характеризует не только вид в целом, но и его отдельные популяции, представленные конкретными штаммами возбудителя. С помощью определенных методов удается разделить их на клоны, различающиеся рядом признаков. Возможно,, долевым участием вирусных частиц с различной выраженностью биологических свойств и определяется факт совместной циркуляции штаммов, обладающих разной вирулентностью. Это может служить одной из причин заболевания клещевым энцефалитом лиц с высоким содержанием антител в крови; заслуживают также внимания данные о существовании у вируса фракции,, которая не поддается нейтрализации даже при избытке специфических антител.
Распространенность и элементы экологии возбудителя
Природные очаги клещевого энцефалита приурочены к лесным ландшафтам Северной Евразии, в определенной мере обеспеченным теплом и влагой. Нозоареал вытянут в широтном направлении от Атлантического до Тихого океанов; на территорию СССР приходится его основная часть с наиболее напряженными очагами. Внутренняя структура нозоареала обусловлена рядом природных и антропогенных факторов, от которых зависит наличие, плотность популяций и стабильность численности хозяев вируса (прежде всего иксодовых клещей и мелких лесных млекопитающих) и, следовательно, интенсивность эпизоотического процесса. Последним и определяется потенциальная эпидемиологическая опасность ландшафтов с точки зрения риска заражения людей. Зараженность клещей вирусом установлена в подавляющем большинстве природноочаговых местностей. Вместе с тем, разнообразие применявшихся методик не позволяет сопоставить результаты исследований (Е. Н. Левкович и соавт., 1967) и дать сравнительную количественную характеристику эпизоотического процесса по этому критерию. Решение данного вопроса на основе применения современных лабораторных методов представляет одну из важнейших задач дальнейшей научной и практической разработки проблемы клещевого энцефалита.
Взаимодействие популяций вируса с популяциями мелких млекопитающих – непременное условие существования его как вида. Участие в эпизоотическом процессе лесных видов землероек (преимущественно бурозубок) и хомякообразных( прежде всего – красной и рыжей полевок), а также ежей, беличьих, мышей обеспечивает поддержание инфицированности иксодид и сохранение общего баланса возбудителя в составе биоты ландшафтов. Такая «горизонтальная» передача вируса компенсирует потери, которые он испытывает в процессе «вертикальной» (трансовариальной и трансфазовой) передачи по ходу цикла развития иксодовых клещей.
В современную естественно-историческую эпоху экология вируса характеризуется теснейшим переплетением атавистически древнего «вертикального» и эволюционно вторичного «горизонтального» путей расселения. В обоих случаях иксодовые клещи играют «узловую» роль – в их численности и вирусофорности находит интегрированное выражение обширный комплекс абиотических и биотических факторов, прямо или косвенно определяющих экологию возбудителя в конкретных ландшафтных условиях.
Исключительно важную роль играют иксодиды и как предпосылка эпидемиологических проявлений природных очагов. Изложенным определяется то, что в прикладном плане исследованию клещей на зараженность вирусом должно быть придано принципиальное значение.
Вирусологическое и иммунологическое обследование теплокровных животных сохраняет свою роль преимущественно в научных исследованиях. При изучении иммунной прослойки среди мелких лесных млекопитающих необходимо учитывать, что сезонный ход иммунизации зверьков различен у разных видов, а у одного и того же вида может варьировать по годам. Поэтому для получения представительных и сравнимых данных, которые могли бы использоваться для эпидемиологической оценки эпизоотического процесса, первостепенное значение имеет методическая сторона медико-зоологических работ. Подлежат дальнейшей разработке и унификации экологические и иммунологические критерии, позволяющие интерпретировать результаты обследования мелких млекопитающих с целью оценки потенциального эпидемиологического значения ландшафтов. Значение в экологии вируса такой группы теплокровных хозяев как птицы еще не получило единогласной оценки. По всей вероятности, птицы имеют определенное значение в существовании вируса как вида, причем в разных участках нозоареала их роль может быть различной. Однако, в отличие от японского энцефалита эта ветвь эпизоотического процесса в современных условиях является изолированной и не имеет непосредственной эпидемиологической проекции.
Эпидемиологические и клинические черты
Непосредственным источником вируса для человека служат или лесные виды иксодид (прежде всего I. persulcatus, I. ricinus), или домашние козы, инфицируемые клещами и выделяющие вирус с молоком. В большинстве природноочаговых местностей доминирует трансмиссивный путь заражения людей; на его долю приходится около 90% всех случаев клещевого энцефалита в РСФСР за послевоенные годы. Среди заразившихся преобладают лица старших возрастных групп; характер заболеваемости приближается к спорадической. В отличие от этого, алиментарный путь инфицирования (при употреблении некипяченого молока коз) проявляется преобладанием среди больных, детей до 15 лет, а заболеваемость имеет характер семейно-групповых вспышек.
Клиническое течение инфекции в настоящее время характеризуется постепенным и повсеместным смягчением и уменьшением числа прогредиентных форм. Вместе с тем, участились случаи выявления паралитических поражений без начального лихорадочного периода. Ведущее значение во всех очагах имеют стертые и легкие формы, на фоне которых с различной частотой встречаются случаи тяжелого течения. При наличии в одном и том же районе случаев алиментарного и трансмиссивного происхождения тяжесть клиники и частота инвалидизирующих остаточных явлений в том и другом случае существенно не отличаются.
Организационные вопросы применения лабораторных методов
В течение почти четырех десятилетий возбудитель клещевого энцефалита является объектом интенсивных исследований как за рубежом, так и, особенно, в СССР. На основе разработки фундаментальных вопросов антигенного строения, биологии, взаимодействия с организмом животных и с тканевыми системами к настоящему времени предложен широкий круг лабораторных методов выявления вируса и антител к нему. Ценность каждого из них зависит не только от специфичности, но также от доступности (особенно в практических условиях), а также от целей исследования. При разработке вопросов природной очаговости и эпидемиологии клещевого энцефалита в условиях практических учреждений лабораторные методы исследования должны применяться в двух принципиально важных направлениях.
Первым направлением является планомерное обследование типичных для области, края или республики ландшафтов на наличие природных очагов клещевого энцефалита, выяснение их распространенности и напряженности эпизоотического процесса. Окончательная цель этой работы — количественное обоснование степени потенциальной опасности заражения клещевым энцефалитом людей в условиях конкретных ландшафтов и далее — разработка ландшафтно-эпидемиологического прогноза и дифференцированной системы профилактики, включая санитарно-просветительную работу, показания к активной и пассивной иммунизации, целенаправленные хозяйственные мероприятия. Первостепенной по важности задачей в данном случае является определение зараженности вирусом взрослых клещей. Как указывалось выше, в этом показателе находят концентрированное выражение многие факторы, определяющие экологию вируса в тех или иных ландшафтных условиях; не менее важно, что взрослые клещи имеют непосредственное эпидемиологическое значение. Исследованию подлежат в первую очередь иксодиды абсолютно доминирующего в данном ландшафте вида. Сбор их для исследования должен производиться параллельно с учетом численности; организация учетов излагается во «Временной программе наблюдений за состоянием природных очагов клещевого энцефалита и методических указанных по ее выполнению» (Главное санитарно-эпидемиологическое управление Министерства здравоохранения РСФСР, М., 1966). Целесообразно проводить параллельные сборы в ландшафтах, контрастных по природным особенностям и численности клещей, а также по количеству ранее зарегистрированных заболеваний клещевым энцефалитом.
До последнего времени общепринятой методикой исследования клещей на присутствие вируса являлись групповые пробы по 10 экземпляров (В. Н. Беклемишев, 1963; С. Я. Гайдамович, 1964 и др.). Однако опыт исследований и анализ теоретических основ такого подхода (Л. Г. Гольдфарб и В. А. Заклинская, 1969; С. А. Бурлаков и В. Н. Паутов, 1975 и др.) показывает, что получаемые при этом результаты позволяют сделать заключение лишь о наличии или отсутствии вируса в данной партии, а не о доле инфицированных особей в выборке. Поэтому для получения доказательных данных о сравнительной частоте вирусофорности иксодид необходимо их исследование индивидуально. Распространенное мнение о чрезмерной трудоемкости метода индивидуальных проб преувеличено; опыт показывает, что соответствующая организация подготовки и исследования материала позволяет силами 2-3 сотрудников обрабатывать не менее 1000 экз. клещей за сезон.
Вирусологическое и иммунологическое исследование второстепенных по численности иксодид, а также других беспозвоночных и позвоночных животных из состава очаговых биоценозов может осуществляться при наличии достаточных сил и с учетом методических особенностей сбора материалов и интерпретации результатов, о которых частично говорилось выше.
Вторым направлением применения лабораторных методов является изучение эпидемиологической проекции природных очагов. В отличие от рассмотренного выше первого направления (цель которого — количественная оценка потенцильной опасности ландшафтов и прогноз риска заражения), целевая установка сводится здесь к ретроспективному выявлению случаев стертого или бессимптомного инфицирования, а также к подтверждению клинического диагноза клещевого энцефалита у госпитализированных больных. В эпидемиологическом плане задачей первостепенной важности является подбор контингентов людей для иммунологического обследования. Обследованием должны быть охвачены жители характерных населенных пунктов (поселки леспромхозов и лесхозов; поселки совхозов и колхозов; районные центры). В пределах каждого из них по принципу случайной выборки сыворотки крови собираются поровну от: а) детей и подростков (7-16 лет); б) работающих взрослых (17-55 лет); в) пенсионеров и домашних хозяек. Сыворотки в стерильных пробирках под резиновыми пробками или в запаянных ампулах до исследования хранятся в холодильнике при + 4°; если позволяют условия, сыворотки следует заморозить при 15-20°; они размораживаются по мере необходимости и в дальнейшем хранятся при +4° без повторного замораживания. Необходима четкая документация сывороток с указанием района, сельсовета и населенного пункта, фамилии, инициалов, возраста, профессии обследуемого. Эти данные, наряду с результатами исследования, могут быть впоследствии закодированы на перфокартах, что облегчает обработку результатов. Пункты сбора сывороток целесообразно выбирать в местностях, где изучается зараженность вирусом клещей. Это позволит сопоставить результаты оценки потенциальной опасности ландшафтов с ее эпидемиологическими проявлениями.
Лабораторные методы исследования
Исследование клещей на вирусофорность
Голодных клещей обрабатывают общепринятыми способами (эфир или 70° спирт- антибиотики – физиологический раствор) и растирают поодиночке с добавлением 1,5-2 мл солевого раствора. Рекомендуется использовать фосфатный буферный раствор с pH=7,2-7,4 и лишь в крайнем случае – физиологический раствор нейтральной реакции (С. Я. Гайдамович, 1964). К буферу добавляется по 200 ЕД пенициллина и стрептомицина на 1 мл и 2% кристаллического бычьего альбумина. После 20 часовой экстракции при +4° суспензии центрифугируют при 2000 об/мин в течение 10 мин. Надосадочную жидкость используют для заражения белых мышей или тканевых культур.
Заражение белых мышей может производиться или в расчете на выделение вируса и его дальнейшую идентификацию, или с целью индикации его методом флуоресцирующих антител, а также косвенного выявления по иммунологическим сдвигам у животных.
Для выделения вируса каждой суспензией заражают партию из 5 мышей весом 8-10 г, вводя по 0,03 мл материала в мозг. Если в течение 5-6 дней мыши не заболевают, проводят 2-3 слепых пассажа с недельными интервалами. Заболевших мышей забивают, головной мозг стерильно извлекают и приготавливают из него суспензии; последние служат материалом для получения антигенов и дальнейшего заражения животных с целью идентификации вируса. У оставшихся в живых мышей забирают кровь для исследования в реакции торможения гемагглютинации с коммерческим антигеном.
В целях идентификации вируса с возбудителем клещевого энцефалита применяются реакции торможения гемагглютинации (РТГА), связывания комплемента (РСК), нейтрализации (PH). Первая из них основана на способности гусиных эритроцитов склеиваться вследствие адсорбции ими гемагглютининов вируса клещевого энцефалита. Воспроизведение эффекта гемагглюти» нации и торможения ее специфической сывороткой требует соблюдения определенных условий pH, температуры и солевого состава сред.
Оптимальными являются pH = 6,8-7,0 и температура + 4°. Поскольку агглютинация наиболее четко проявляется в кислой среде, а сами гемагглютинины в этих условиях разрушаются, все разведения вируса делают на щелочном боратном буфере с pH = 9,0, а затем добавляют эритроциты, взвешенные в кислом фосфатном буфере с pH = 6,2; при смешивании создается нужная реакция среды. В реакции гемагглютинации определяется титр гемагглютининов, т. е. предельное разведение материала, вызывающее четкую агглютинацию эритроцитов. Это разведение считается одной антигенной единицей (АЕ). В реакции торможения гемагглютинации специфической сывороткой антиген применяется в разведении, соответствующем 8АЕ; сыворотка должна быть предварительно адсорбирована гусиными эритроцитами.
Реакция торможения гемагглютинации, так же как и дополняющая ее реакция связывания комплемента, позволяет идентифицировать вирус на основе взаимодействия его отдельных антигенных компонентов с известной специфической сывороткой. Поэтому необходимой предварительной процедурой для постановки этих реакций является приготовление из мозговых суспензий заболевших мышей гемагглютинирующего и комплемент- связывающего антигенов. В реакции нейтрализации критерием является отсутствие размножения вируса, определяемое по тому или иному видимому признаку. При постановке ее в классическом варианте на мышах таким признаком является выживание или гибель животных, которым введена смесь цельной сыворотки с соответствующими разведениями вируссодержащего материала. При постановке в тканевых системах в качестве признаков нейтрализации вируса предложены тесты, свидетельствующие о подавлении его метаболической активности, цитопатического или интерферирующего действия, способности к гемадсорбции и продукции гемагглютининов. Техника приготовления гемагглютинирующего и комплементсвязывающего антигенов, методика постановки этих реакций (равно как реакции нейтрализации на мышах и в тканевых культурах), статистические методы обработки результатов и их интерпретация подробно излагается в ряде методических указаний, монографических и справочных изданий: С. Я. Гайдамович, 1964; Е. Н. Левкович и соавт., 1967; С. П. Карпов и Ю. В. Федоров, 1969; Методические указания по вирусологической и серологической диагностике клещевого энцефалита (Томский НИИ вакцин и сывороток, Томск, 1972); Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования, 1973, и др.
Исследование зараженности иксодид посредством выделения вируса на мышах и идентификации его с помощью перечисленных серологических реакций имеет ряд недостатков. При общей высокой патогенности возбудителя для белых мышей часть штаммов не вызывает у них клинически выраженной инфекции и накопления вируса в мозгу, что может объясняться вариациями его биологических свойств, индивидуальной чувствительностью животных и пр. Существенное значение имеет также продолжительность и трудоемкость процедур по приготовлению многочисленных мелких партий мозговых антигенов. В связи с этим заслуживают внимания и дальнейшей разработки методические приемы ускоренной индикации и идентификации возбудителя при использовании белых мышей для массового обследования клещей на вирусофорность.
Одним из них является метод флуоресцирующих антител (МФА), применяемый для обнаружения вируса в мазках-отпечатках мозга мышей, зараженных клещевыми суспензиями. Неспецифическое свечение фона отпечатков подавляется контрастированием с помощью бычьего альбумина, меченого родамином (выпускается в качестве коммерческого препарата), а также предварительной адсорбцией люминесцирующей сыворотки мозговой тканью заведомо здоровых мышей. Препятствием для широкого внедрения данного метода в практику является отсутствие коммерческих люминесцирующих сывороток для прямого иммуно-флуоресцентного анализа. Поэтому целесообразно использование реакции непрямой иммуно-флуоресценции, когда немеченая специфическая сыворотка применяется для присоединения к антигену, а образовавшийся комплекс выявляется с помощью люминесцирующей антивидовой сыворотки; коммерческие люминесцирующие сыворотки против глобулинов человека, барана, кролика, лошади, морской свинки и др. выпускаются Институтом эпидемиологии и микробиологии им. Гамалеи АМН СССР (Москва). МФА в его прямом и непрямом вариантах зарекомендовал себя в качестве перспективного способа быстрой индикации и идентификации вируса клещевого энцефалита при экспериментальных и клинико-иммунологических исследованиях (Е. Н. Левкович и соавт., 1967; С. А. Бурлаков и В. Н. Паутов, 1975 и др.), что позволяет надеяться на использование его при широком обследовании клещей путем биопроб на мышах.
В тех случаях, когда при наличии вируса в клещевых суспензиях смертельной инфекции у заражаемых мышей не возникает (и, соответственно, может не происходить накопления в мозгу возбудителя, выявляемого с помощью МФА), целесообразно серологическое обследование животных. Показано, что иммунологический эффект достигается дозами вируса в 109 раз меньше тех, которые вызывают смертельную инфекцию мышей (Л. Г. Гольдфарб и В. А. Заклинская, 1969). На этом основании указанные авторы предлагают определять зараженность клещей косвенными (серологическими) методами, видя в последних один из наиболее чувствительных способов индикации возбудителя, даже если он обладает пониженной вирулентностью для белых мышей.
Заражение тканевых культур клещевыми суспензиями (как и другими вируссодержащими материалами) признается не менее, а часто более чувствительным способом выявления возбудителя, чем инфицирование белых мышеи. В числе достоинств метода по сравнению с заражением животных, кроме более высокой чувствительности, отмечаются его быстрота, экономичность, возможность использования для индикации и идентификации возбудителя не только клеточной, но и жидкой фазы, в которой происходит интенсивное накопление вируса. По сводным данным Е. Н. Левкович, В. В. Погодиной, Г. Д. Засухиной и Л. Г. Карпович (1967) чувствительность к вирусу показана более чем для 30-ти первично трипсинизированных и перевиваемых клеточных культур. Многообразие применяемых тканевых систем и приемов их использования создает известные трудности в рекомендации метода, сочетающего чувствительность к возбудителю, возможность его идентификации и доступность для практических учреждений, призванных проводить массовое обследование клещей с изложенными выше целями.
Наиболее простым и доступным для большинства лабораторий является использование неприхотливой, но высокочувствительной к вирусу клещевого энцефалита первично трипсинизированной культуры куриных эмбриональных фибробластов. (КЭФ). По имеющимся данным (Е. Н. Левкович и соавт., 1967), на ней удается выявлять концентрации вируса на 1-2 порядка меньшие, чем в опытах интрацеребрального заражения белых мышей.
Использование этой тканевой системы требует дополнительных методов выявления вируса, поскольку инфекция клеток в ней протекает латентно, без цитопатического эффекта. Индикация и идентификация возбудителя в жидкой фазе посредством РСК, РГА и РТГА недостаточно эффективна потому, что в культуре КЭФ гемагглютинирующий и комплёментсвязывающий антигены накапливаются лишь при определенных условиях и высоких заражающих дозах вируса. Поэтому в качестве наиболее рациональной схемы индикации вируса в культуре КЭФ предлагается иммунофлуоресцентная микроскопия клеточного пласта с параллельным исследованием жидкой фазы в реакции непрямой гемагглютинации (РНГА). Окончательная идентификация проводится в реакции торможения непрямой гемагглютинации (РТНГА) со специфической иммунной сывороткой (Ф. С. Носков и соавт., 1970).
При подготовке тканевой системы трипсинизированную ткань куриного эмбриона разводят средой 199 или гемогидролизатом (к которым добавлено 10% инактивированной бычьей сыворотки) до концентрации 500 тыс. клеток в 1 мл и разливают по 1,5 мл в пробирки или пенициллиновые флаконы с пластинками из слюды (можно использовать также разрезанные пополам покровные стекла). После 24-48-часовой инкубации (в зависимости от состояния развивающегося на пластинке клеточногомонослоя) ростовую среду заменяют поддерживающей (без сыворотки) и вносят во флаконы по 0,2 мл исследуемой клещевой суспензии.
Зараженные культуры инкубируются также при +37°; через 72 часа пластинки извлекают, споласкивают фосфатным буфером с pH =7,2, подсушивают при комнатной температуре и фиксируют в ацетоне, после чего наклеивают на предметные стекла кверху монослоем. Окрашивание опытных и контрольных препаратов люминесцирующей сывороткой в прямом и непрямом вариантах производится по общепринятой методике (Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования, 1973).
Препараты просматриваются в люминесцентном микроскопе с иммерсионной системой; в качестве иммерсионной жидкости обычно используется диметилфталат. Наличие вирусного антигена проявляется специфической флуоресценцией, которая всегда имеет цитоплазматическую локализацию. Вначале вокруг ядра появляются отдельные светящиеся гранулы, которые постепенно сливаются в сплошной ободок; затем зона свечения расширяется, захватывая всю цитоплазму, которая флуоресцирует диффузно или в виде скоплений глыбок.
Одновременно с извлечением пластинок для иммуно-флуоресцентного исследования производится пассаж жидкой фазы, а также исследование ее в РНГА и РТНГА. Для постановки реакций используются бараньи эритроциты, сенсибилизированные противоэнцефалитным гаммаглобулином производства Томского НИИ вакцин и сывороток (Р. Е. Коникова и соавт., 1968).
Заслуживает серьезного внимания вопрос об индикации и идентификации вируса непосредственно в клещах или приготовленных из них суспензиях. Наряду с применением МФА, в этом плане представляют интерес данные об эффективности РГА и РТГА с суспензиями клещей, используемыми в качестве антигена (А. В. Пшеничнов и соавт., 1967). В этом случае суспензии приготавливаются на боратном буфере с pH = 9,0 и обрабатываются протаминсульфатом для освобождения от невирусных белков, которые могут играть роль неспецифических ингибиторов гемагглютинации. Метод требует дополнительной апробации в части чувствительности, специфичности РГА и контроля на присутствие ингибиторов; в последнем случае может оказаться приемлемой постановка РГА с суспензиями в присутствии 2 АЕ и 1 АЕ коммерческого гемагглютинирующего антигена.
Иммунологическое обследование людей
В настоящее время ведущими методами иммунологического обследования людей являются РТГА и РСК. В значительной мере этому способствует наличие коммерческих инактивированных антигенов, выпускаемых Московским институтом вирусных препаратов и Томским НИИ вакцин и сывороток. Реакция нейтрализации (на мышах |и в культурах тканей), которая является наиболее чувствительной и высокоспецифичной, вследствие своей сложности, сохраняет значение преимущественно в научных исследованиях. Реакции диффузионной преципитации в агаре и непрямой гемагглютинации пока не получили широкого распространения.
РТГА в течение сравнительно короткого времени приобрела значение основного метода как в диагностике клещевого энцефалита, так и при ретроспективном обследовании практически здоровых лиц с целью выявления среди них иммунной прослойки. Антигемагглютинины появляются в диагностических титрах (1 :20) на 3-5 дни заболевания и после 16-го дня обнаруживаются почти у всех больных; по истечении примерно трех недель концентрация их достигает высоких значений – до 1:1280. Подобно вируснейтрализующим антителам, антигемагглютинины могут сохраняться у человека многие годы. Это служит предпосылкой применения РТГА в эпидемиологических целях – для выявления масштабов суммарной инфицированности населения вирусом в результате многолетнего соприкосновения с природными очагами. Сбор сывороток целесообразно проводить осенью (октябрь-ноябрь), поскольку в этом случае можно не только выявить наиболее высокие титры антигемагглютининов, но обнаружить одновременно и комплементсвязывающие антитела, свидетельствующие об инфицировании не ранее, чем в минувшем сезоне (см. ниже).
При серологическом обследовании больных с клиническим диагнозом клещевого энцефалита или подозрением на него, необходимо исследование парных сывороток, поскольку даже относительно высокие титры антигемагглютининов могут иметь анамнестический характер. Первую сыворотку необходимо брать не позднее 5-7-го дней заболевания, так как к этому времени уже заканчивается формирование иммунологического фона инфекции. Вторая сыворотка берется через 4 недели, когда нарастание титров достигает достоверной 4-кратной разницы.
Методика постановки РТГА относительно несложна и подробно излагается в инструкции, прилагаемой к антигену, а также в «Методических указаниях по вирусологической и серологической диагностике клещевого энцефалита» Томского НИИ вакцин и сывороток (Томск, 1972). Сыворотки перед постановкой реакции обязательно обрабатывают каолином и гусиными эритроцитами. Буферные растворы (боратный с pH = 9,0 и фосфатный, с pH =6,2) выпускаются Томским НИИ вакцин и сывороток или могут быть приготовлены по соответствующим прописям (Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования, 1973). Постановку реакции удобно осуществлять в полистироловых пластинах с лунками; пластины моют без мыла (во избежание неспецифической агглютинации эритроцитов), тщательно прополаскивают и замачивают в дистиллированной воде на несколько суток, а затем протирают лунки ватным тампоном на корнцанге.
РСК как метод обнаружения антител к вирусу клещевого энцефалита менее чувствительна, чем РТГА и достигает максимальных титров (1:64– 1:256) позднее – на 4-10 неделях заболевания, Однако это имеет свои преимущества в тех случаях, когда первая сыворотка взята поздно и четырехкратный прирост антител не может быть установлен по данным РТГА. Комплементсвязывающие антитела исчезают из крови, как правило, уже через 1 год после инфицирования, На этом основано применение РСК при осеннем исследовании сывороток для выявления доли лиц, заразившихся в природных очагах в течение прошедшего весенне-летнего сезона. Методика постановки РСК громоздка по сравнению с РТГА, поэтому при массовом обследовании населения для выявления иммунной прослойки ее можно ставить только с теми сыворотками, которые дали положительный результат в РТГА; в принципе возможные единичные положительные результаты РСК при отрицательных в РТГА не играют в данном случае решающей роли.
Однако при индивидуальном обследовании больных обе реакции должны ставиться параллельно.
Изложенное выше свидетельствует о том, что в настоящее время имеется принципиальная возможность широкого применения практическими учреждениями лабораторных методов при решении вопросов эпизоотологии, эпидемиологии, распространенности клещевого энцефалита. Прежде всего это касается иммунологических реакций с сыворотками людей (РТГАиРСК), для постановки которых имеются коммерческие антигены, а эффективность использования показана многочисленными исследованиями.
Естественно, более сложен вопрос о применении вирусологических методов исследования, в частности при массовом обследовании иксодовых клещей для суждения о наличии, ландшафтном распределении и напряженности природных очагов энцефалита. Задачи исследования значительных количеств иксодид в индивидуальных пробах заставляет ориентироваться при индикации и идентификации вируса на такие ускоренные приемы как МФА и РНГА, что естественно, не исключает поисков и апробации других методических подходов.
