Иммунологические методы исследования
Иммунологические методы исследования основаны на обнаружении в моче обследуемой женщины хорионического гонадотропина. Они используются в последние годы для диагностики ранних сроков беременности наряду с биологическими реакциями. Преимуществом серологических (иммунологических) тестов является их достаточно высокая специфичность, быстрота и относительная простота выполнения. Для проведения реакций не требуется сложного оборудования. Применение иммунологических тестов практически исключает получение ложных положительных результатов, связанных с приемом гормональных препаратов. Эти тесты обладают большой точностью (до 98-99% положительных результатов), дают возможность обнаружить незначительные количества хорионического гонадотропина, что особенно важно при диагностике начальных сроков беременности. В нашей стране наибольшее распространение получила методика количественного определения хорионического гонадотропина по Виде и Гемзеллу в модификации Котлярской, состоящая из следующих этапов.
Иммунизация кроликов
Антигенную эмульсию готовят, растворяя 3000 ME хориогонина в 0,4 мл стерильного физиологического раствора, содержащего 0,1 мл вакцины БЦЖ. К раствору прибавляют 0,6 мл вазелинового масла и смесь встряхивают до образования стойкой эмульсии. Полученную антигенную эмульсию вводят крольчихам весом 2,2-2,5 кг под кожу в область паховых лимфатических узлов. Всего делают 3 инъекции с интервалами между ними 2 нед. Через 2 нед после последней подкожной инъекции крольчихе вводят в краевую вену уха 3000 ME хориогонина, растворенного в 2 мл стерильного физиологического раствора. Через 10-12 дней у нее берут 20-30 мл крови из вены уха. Полученный титр антител в сыворотке животного (1:1280—1:2560) обычно уже достаточен для проведения дальнейшей работы. При низком титре следует произвести добавочную инъекцию хориогонина. Перед повторным взятием крови также следует за 2 нед провести ревакцинацию или подкожно антигенной эмульсией или внутривенно 2 мл физиологического раствора, содержащими 1500 ME хориогонина.
Обработка антисыворотки
Взятую у иммунизированной крольчихи из вены уха кровь оставляют на сутки в холодильнике при 4°. Через сутки верхний слой (антисыворотку) разливают в пробирки по 1,5 мл и помещают на 30 мин в водяную баню для прогревания (инактивации) при 56°. После охлаждения в каждую пробирку для консервации антисыворотки добавляют по 2-3 мг азида (или мертиолата) натрия. Затем антисыворотку замораживают, и в таком состоянии ее можно хранить длительное время. Перед применением антисыворотку следует «истощать», для чего 1,5 мл антисыворотки смешивают с 0,75 мл формалинизированиых эритроцитов и оставляют при комнатной температуре. Время «истощения» зависит от степени загрязнения антисыворотки посторонними инородными телами. Для антисыворотки, взятой у кролика первый раз после иммунизации, этот период обычно составляет 20-30 мин. При повторных иммунизациях одного и того же кролика титр посторонних антител в сыворотке увеличивается и время «истощения» антисыворотки удлиняется. После «истощения» антисыворотку отделяют центрифугированием и хранят в замороженном виде. В связи со сказанным не рекомендуется использовать одно и то же животное более года.
Обработка эритроцитов
Для обработки эритроцитов необходимы следующие реактивы и растворы. Буферные растворы: а) фосфатно-солевой буфер рН 7,2 готовят смешиванием 100 мл физиологического раствора со 100 мл буферной смеси, содержащей 77 мл 0,15 М раствора двузамещенного фосфата натрия (безводного) и 23 мл 0,15 М раствора однозамещениого фосфата калия; б) фосфатно-солевой буфер рН 6,4 готовят смешиванием 100 мл физиологического раствора со 100 мл буферной смеси, содержащей 35 мл 0,15 М раствора двузамещенного фосфата натрия (безводного) и 65 мл 0,15 М раствора однозамещенного фосфата калия. Буферные растворы должны быть приготовлены на свежей дистиллированной воде.
Формалин. Концентрированный х. ч. формалин доводят до рН 7,01 N раствором едкого натра и, добавляя фосфатно-солевой буфер рН 7,2, получают 3% раствор.
Таниновая кислота. Раствор таниновой кислоты в концентрации 1 : 40 000 готовят на фосфатно-солевом буфере рН 6,4 за час до танизации. Свежие эритроциты овцы отмывают фосфатно-солевым буфером рН 7,2 до тех пор, пока надосадочная жидкость не станет прозрачной. Скорость центрифугирования при отмывке свежих эритроцитов не должна превышать 1000 об/мин.
Формалинизация. 1 объем 3% нейтрального раствора формалина смешивают с 1 объемом 8% взвеси эритроцитов (формалин и взвесь готовят на буфере рН 7,2). Смесь оставляют на 20-22 ч в термостате при 37°, периодически встряхивая. После инкубации эритроциты 3 раза промывают 8 объемами фосфатно-солевого буфера рН 6,4.
Танизация. Таниновую кислоту растворяют в буфере рН 6,4 в концентрации 1:40 000 и на этом растворе готовят 2% взвесь эритроцитов. Взвесь инкубируют на водяной бане при 56° в течение 30 мин. Время отсчитывают с момента достижения 56°. После инкубации смесь центрифугируют, надосадочную жидкость сливают, добавляют тот же объем раствора таниновой кислоты (1:40000 в буфере рН 6,4) и снова инкубируют в течение 30 мин при указанной температуре. После танизации эритроциты промывают 3 раза 10 объемами фосфатно-солевого буфера при рН 6,4.
Адсорбция хориогонина на эритроцитах. На фосфатно-солевом буфере рН 6,4 готовят 3,3% взвесь формаллизированных, танизированных эритроцитов. Затем взвесь смешивают с таким же объемом фосфатно-солевого буфера рН 6,4, содержащего в I мл 25 ME хориогонина. Смесь инкубируют 2 ч на водяной бане (56°). После инкубации взвесь 4 раза промывают 10 объемами фосфатно-солевого буфера при рН 6,4.
Приготовление рабочей взвеси эритроцитов. Из танизированных, формалинизированных и заряженных хориогонином эритроцитов готовят 3% взвесь на фосфатно-солевом буфере рН 6,4. Для консервации добавляют азид (или мертиолат) натрия из расчета 20 мг на 100 мл взвеси. В таком виде при температуре не выше 4° взвесь можно сохранять до 6 мес. Для лучшей сохранности эритроцитов требуется периодически заменять надосадочную жидкость тем же количеством буферного раствора, содержащего консервант.
Реакция агглютинации (определение титра антисывороток и проверка качества эритроцитов)
Для постановки реакции агглютинации удобно пользоваться специальными матрицами из плексигласа с 6 рядами лунок 15x15 мм. В каждом ряду имеется 12 лунок. Для одного опыта требуется 12-18 лунок. В них, начиная со 2-й, наливают по 0,4 мл фосфатно-солевого буфера рН 6,4. Исследуемую антисыворотку разводят тем же буферным раствором в 10 раз и наливают ее по 0.4 мл в 1-ю и 2-ю лунки. Далее, начиная со 2-й лунки, готовят последовательный ряд разведений антисыворотки: 1 :20, 1 : 40, 1 : 80 и т. д. посредством переноса 0,4 мл смеси из 2-й лунки в 3-ю, из 3-й — в 4-ю и т. д. В каждую лунку добавляют по 0,05-0,06 мл 3% взвеси формалинизированных, танизированных и заряженных хориогонином эритроцитов. Затем матрицу осторожно встряхивают до полного смешивания содержимого лунок и оставляют при комнатной температуре. Реакцию оценивают через 1.5-2 ч.
Титр антисыворотки — обратная величина ее наивысшего разведения, еще дающего полную реакцию агглютинации. Например, если реакция агглютинации заканчивается при разведении антисыворотки 1 : 1280, это означает, что титр антисыворотки равен 1280. Данную реакцию ставят не только для качественного исследования на хорионический гонадотропин (см. выше), но и для количественного определения этого гормона.
1. Утреннюю порцию мочи (2-5 мл) фильтруют через бумажный фильтр. Затем готовят ряд последовательных разведений. Для этого в ряд лунок матрицы (со 2-й по 11-ю) наливают по 0,4 мл фосфатно-солевого буфера при рН 6,4, а в 12-ю лунку (контрольную) вносят 0,2 мл. Затем в 1-ю и 2-ю лунки вносят по 0,4 мл, а в контрольную — 0,2 мл профильтрованной мочи. Содержимое 2-й лунки (0,8 мл) перемешивают и 0,4 мл смеси переносят в 3-ю лунку, из 3-й — в 4-ю и т. д. (включая 11-ю лунку). Таким образом, получают ряд разведений мочи: 1 : 2, 1 : 4. 1 : 8 и т. д.
2. Из стандартного препарата хорионического гонадотропина готовят основной раствор, содержащий 400 ME гормона в 1 мл фосфатно-солевого буфера при рН 6,4. Этот раствор хранят в замороженном виде и используют в течение 5-7 дней. В дни определений из основного раствора готовят на фосфатно-солевом буфере рН 6,4 два раствора, содержащих 40 и 5 ME в 1 мл, что соответствует 40 000 и 5000 ME в 1 л мочи. Из этих двух растворов готовят ряды разведений, применяя ту же технику, что и при разведении мочи. Таким образом, получают два ряда разведений хорионического гонадотропина: 1-й ряд — 1:40 000, 1:20 000, 1:10 000, 1 :5000 ME в 1 л и т. д.; 2-й ряд — 1 : 5000, 1 : 2500 ME в 1 л и т. д.
3. Антисыворотку, титр которой ранее был установлен по реакции агглютинации, разводят буферным раствором при рН 6,4 в соотношении 10 : титр. Например, если титр антисыворотки равен 1280, ее разводят 1 : 128. Разведенную антисыворотку добавляют по 0,05-0,06 мл (по капле) во все лунки с мочой и во все лунки с разведенным хориогонином, за исключением контрольных. Матрицу осторожно встряхивают и добавляют во все лунки по 0,05-0,06 мл 3% формалинизированных, танизированных и заряженных хориогонином эритроцитов. Матрицу встряхивают до полного смешивания содержимого лунок и оставляют на ровной поверхности. Результаты реакции регистрируют через 1-1.5 часа.
4. Хорионический гонадотропин, содержащийся в образцах исследуемой мочи, тормозит реакцию гемагглютинации между антисывороткой и заряженными хориогонином эритроцитами, вследствие чего они оседают на дне лунок в виде кольца или пуговки. При определении количества хориального гонадотропина в моче отмечают последние лунки в рядах разведений мочи и хориогонина, давших торможение реакции. Торможение реакции агглютинации в двух рядах разведений хориогонина должно происходить при одинаковых концентрациях гормона. Например, если в 1-м ряду торможение закончилось при разведении 40 ООО ME в 1 л в 128 раз, то во 2-м ряду торможение должно заканчиваться при разведении 5000 ME в 1 л в 16 раз. Если совпадения нет, основной раствор гормона (400 ME в 1 мл) нужно заменить новым. Расчет количества хорионального гонадотропина в исследуемой моче производят таким образом. Предположим, что в ряду разведений мочи торможение реакции агглютинации закончилось в лунке с разведением 1 : 16, тогда в 1 л мочи содержится 40000/128=5000 ME.
Содержание хориального гонадотропина в образцах мочи выражают в международных единицах на 1 л мочи. В контрольных лунках эритроциты должны осесть на дне в виде кольца или пуговки. При неспецифической реакции следует взять новый образец мочи.
