Нефелометрические методы в определении аналитов в биоматериалах
В данной статье будут рассмотрены принцип и виды нефелометрического анализа, устройство приборов для нефелометрии и области применения нефелометрии в клинической лабораторной диагностике
Принцип и виды нефелометрического анализа
Нефелометрия — метод определения концентрации, размеров и (или) формы частиц веществ, находящихся в состоянии тонких взвесей, эмульсий или коллоидных растворов, путем измерения интенсивности их светорассеяния. Когда мутный раствор помещают в кювету фотометрического прибора, то световой поток, проходя через кювету, будет наталкиваться на частицы в растворе и изменять свое направление, отклоняясь под разными углами. Это явление и носит название светорассеяния. Оно зависит от длины волны, частоты, интенсивности светового потока, а также свойств рассеивающей среды: размеров частиц, их формы, количества, способности к поляризации и др.
Нефелометрия изучает свечение, которое возникает при освещении исследуемого объекта внешним источником, но в этом случае речь идет не о новом излучении, а о рассеянии света. Поэтому длины волн света возбуждения и излучения при нефелометрии практически совпадают.
Характер (тип) рассеивания зависит от соотношения длины волны света (X) и размера частицы, на которой оно происходит. Если размер частиц рассеивающей реакционной смеси значительно меньше длины волны светового потока, проходящего через кювету, то такой вид светорассеяния называют упругим, или релеевским. В основе его лежит явление дифракции. Каждая частица рассеивает свет независимо от других частиц, и он распространяется во всех направлениях, но максимальное количество света рассеивается под углом 0° и 180° по отношению к лучу, падающему на частицу. Такое светорассеяние дают некоторые белки плазмы, в том числе иммуноглобулины, альбумин, липиды, малые агрегаты в случае ранних иммунологических реакций. Светорассеяние в этом случае симметрично, т.е. рассеиваются равные количества света, как в направлении источника света, так и от него. Для фиолетового света с длиной волны 400 нм это составляет 40 нм, а в красном спектре с длиной волны 700 нм рассеяние света происходит в соответствии с открытыми Релеем закономерностями, если размер частицы меньше 70 нм. Наибольший диаметр молекулы альбумина 8 нм, IgG – 20 нм, а длина нити фибриногена 50 нм. Таким образом, частица агрегата «антиген-антитело», состоящая из нескольких молекул исследуемого белка и антител, в ряде случаев укладывается в размеры релеевской частицы и проявляет ее свойства.
При увеличении размеров частиц (для плазменных белков размер в диапазоне приблизительно от 40 нм до 400 нм) рассеяние становится несимметричным и максимальное количество света рассеивается в направлении падающего луча – преимущественно вперед. Такое светорассеяние называют рассеянием Релея-Дебие. При X = 400 нм этот тип светорассеяния будет характерен для IgM, хиломикронов, формирующихся комплексов антигенов с иммуноглобулинами. В некоторых случаях выгоднее измерять свет, рассеянный не в бок (т. е. под углом 90° к падающему лучу), а под меньшими углами, что повышает чувствительность. В этом случае возбуждающий луч должен быть узконаправленным, что лучше всего обеспечивается лазером. Это послужило причиной появления семейства лазерных нефелометров. Однако в последнее время их успешно вытесняют приборы с ксеноновыми лампами и светодиодами.
В случае если размер частиц превышает длину волны света (в нашем примере, если диаметр частицы более 400 нм), несимметричность светорассеяния еще более увеличивается. При этом по направлению к источнику света рассеивается большее количество света, чем от него. Этот вид рассеяния света, характерен для взвеси бактерий, клеток крови — тромбоцитов и эритроцитов, латексных частиц, белков поздних иммунологических реакций и других крупных частиц. Пропорционально четвертой степени длины волны большая часть энергии рассеивается вперед и назад по отношению к ходу луча.
Интенсивность светорассеяния можно оценивать двояко: либо по количеству рассеянного света, либо по ослаблению прошедшего. В первом случае говорят о нефелометрии, во втором – о турбидиметрии.
Преимущество нефелометрии заключается в том, что можно уловить как очень маленькие, так и очень большие величины рассеянного света. Если раствор прозрачен, постороннего светорассеяния практически нет, чувствительность нефелометрического датчика можно сделать очень высокой, соответственно, будет уловлено появление очень небольшого сигнала. С другой стороны, если светорассеяние велико, чувствительность можно понизить так, чтобы все величины укладывались в шкалу прибора.
При турбидиметрии, где измеряется процент прошедшего света, чувствительность должна быть постоянной, она определяется силой света при измерении фона, поэтому малые или, наоборот, большие степени светорассеяния точно измерить нельзя. Преимущество турбидиметрии состоит в том, что для нее не требуется специальный прибор, измерения могут быть выполнены на том же фотометре или анализаторе, на котором выполняют обычные биохимические исследования.
Нефелометрические измерения можно выполнять по окончании исследуемой реакции – в «конечной точке», т.е. через вполне определенный промежуток времени (20-30 мин), это так называемая статическая нефелометрия. Другой подход – измерение на уровне максимальной скорости реакции – кинетическая, или
скоростная нефелометрия. Она позволяет значительно сократить время анализа.
Устройство приборов для нефелометрии
Прибор для измерения светорассеяния называется нефелометром. В конструктивном отношении флюорометр и нефелометр очень похожи и в определенных случаях может использоваться один и тот же прибор.
В скоростной (кинетической) нефелометрии в качестве источников света используют вольфрамово-галогеновую и кварцевойодную лампы накаливания. Свет от них, пройдя через фильтр (фильтры) и приобретя определенную длину волны, достигает кюветы с измеряемой пробой. В течение некоторого времени избираются различные длины волн, при этом измеряют, например, скорость взаимодействия антител и антигена (гаптена) путем определения максимального светорассеяния на число образующихся комплексов. Высокопроизводительный светодиод (LED) возбуждает свет одной, специфической, длины волны, диапазон длин волн не может быть избран. В качестве источника света в нефелометрах используют также лазеры. Требования к качеству спектров в нефелометрии не очень высоки.
Достаточно дешевые гелиево-неоновые лазеры (к = 633 нм) применяют не из-за спектральной чистоты света, который они излучают, а из-за таких важных для измерения светорассеяния характеристик лазера, как способность излучать свет высокой интенсивности, выходящий узким и строго направленным пучком.
Светорассеяние в нефелометрах регистрирует фотоумножитель (ФЭУ) или силиконовый твердофазный фотодетектор. Оба вида детекторов преобразуют свет в электрические сигналы, но ФЭУ имеет внутренний сигнал амплификаций, который обеспечивает его очень высокую чувствительность. Сигнал от ФЭУ проходит через синхронный демодулятор, который производит сигнал и посылает его в усилитель светорассеяния, сигнал сохраняется и в конечном итоге поступает в компьютер для преобразования в результат. Адекватная стабильность ФЭУ обеспечивается высоковольтным стабилизатором постоянного тока.
На ранних этапах развития нефелометрии детекторы в нефелометрах располагали под углом 90° к исходящему лучу. Однако комплексы «антиген-антитело» относятся к частицам, которые рассеивают свет преимущественно в направлении вперед, поэтому фотодетектор может быть помещен под меньшим углом к исходящему лучу для увеличения чувствительности. При использовании ФЭУ или силиконовые фотодетекторы помещают под углом 70° к проходящему лучу света, в то время как в LED-системах угол расположения фотодиода по отношению к исходящему свету может широко варьировать: от 13-24 до 90° (рис. 1.7). Можно применять вертикальную схему измерения светорассеяния.
Рис. 1.7. Схема устройства нефелометра и турбидиметра:
а - турбидиметр; б – нефелометр, регистрирующий рассеивание света под углом 90°; в – нефелометр, регистрирующий малоугловое рассеивание света (до 30’); 1 – источник света; 2 – оптические линзы; 3 – монохроматор; 4 – кювета с исследуемым образцом; 5 – фильтр детектора; 6 – детектор
Будучи высокочувствительными, нефелометрические методы предъявляют высокие требования к чистоте реактивов, поскольку даже ничтожно малые частицы, попадающие в «фон», в реактивах или пробе, могут давать светорассеяние. В таком случае чувствительность при определении частиц чрезвычайно малых размеров может снижаться. Нефелометр может быть снабжен встроенным дозатором реактивов для автоматического запуска реакции и инкубатором (термостатом), встряхивателем для планшетов. Управлять работой прибора можно с помощью компьютера, программное обеспечение которого позволяет регулировать параметры интенсивности света лампы и коэффициент усиления ФЭУ. В нефелометрии измеряемый результат строго зависит от устройства прибора, различные нефелометры предназначены для специальных методов (например, для определения индивидуальных белков, в том числе и белков «острой фазы» воспаления).
Области применения нефелометрии в клинической лабораторной диагностике. Нефелометрию применяют для определения мутности раствора, чаще всего при количественном определении белков, лекарств по интенсивности светорассеяния преципитатом после проведения реакции «антиген-антитело», но метод находит применение также при выполнении осадочных проб. Высокая чувствительность современных нефелометров позволяет применять эти методы для определения концентрации белков не только в сыворотке или плазме, но и в моче, спинномозговой, суставной и амниотической жидкостях, в элюатах при ионообменной хроматографии.
