Приготовление мазков крови, толстой капли и их окраска
Для проведения данных исследований необходимо следующее оснащение рабочего места:
- Предметные стекла простые и шлифованные.
- Покровные стекла.
- Лоток эмалированный с мостиком для препаратов.
- Промывалка.
- Мерные цилиндры емкостью 100 мл.
- Пинцеты Корне.
- Песочные часы.
- Пипетки градуированные на 1, 2, 5 и 10 мл.
- Краска Романовского.
- Азур.
- Эозин.
- Краска Май-Грюнвальда.
- Краска Лейшмана.
- Метиловый спирт.
- Этиловый 96° спирт.
- Эфир.
- Двууглекислый натрий.
- Ледяная уксусная кислота.
- Дистиллированная вода.
Подготовка предметных стекол для приготовления мазков крови и толстой капли
Качество препаратов крови зависит от чистоты предметных стекол, поэтому новые и бывшие в употреблении стекла подвергают специальной обработке. Для этого с них предварительно удаляют иммерсионное масло кусочком ватки, смоченной бензином или эфиром и помещают на 30 минут в кастрюлю с кипящим мыльным раствором. Многократно промывают водопроводной и дистиллированной водой и помещают в смесь, состоящую из равных частей 96° спирта и эфира. Подготовленные предметные стекла извлекают из смеси с помощью пинцета, вытирают тряпочкой без ворса и, не прикасаясь к ним руками, во избежание загрязнения их поверхности, складывают в коробки, чтобы предохранить от пыли.
Мазки крови приготовляют на чистых предметных стеклах, пользуясь шлифованными предметными или покровными стеклами, чтобы край этих стекол был уже поверхности предметного стекла, на котором готовят мазки, углы стекол иногда надламывают или надпиливают.
Приготовление мазков крови
Прием 1. Предметное стекло захватывают за длинные ребра большим и указательным пальцами правой руки и прикасаются противоположным концом стекла к свежевыступившей капле крови на расстоянии 1-1,5 см от края стекла.
Прием 2. (рис. 29, 1). Предметное стекло располагают между большим пальцем левой руки с одной стороны и указательным и средним - с другой так, чтобы капля крови оказалась сверху и справа.
Прием 3 (рис. 29, 2). Шлифованное предметное или покровное стекло располагают слева и от капли под углом в 45°, при этом его держат большим и указательным пальцами правой руки так, чтобы кончики пальцев касались его длинных ребер.
Прием 4 (рис. 29, 3). Шлифованное предметное или покровное стекло продвигают вправо до соприкосновения с каплей крови и тем самым способствуют распределению крови между стеклами. Когда вся кровь распределится между стеклами (рис. 29, 4), достаточно быстро, спокойно и не надавливая продвигают стекло влево до тех пор, пока капля крови не будет исчерпана (рис. 29, 5, 6). Правильно сделанный мазок равномерной толщины, желтоватого цвета, просвечивает и на конце заканчивается щеточкой; он занимает не более 3/4 и не менее 1/2 длины предметного стекла. Это достигается распределением капли крови, размер которой в диаметре 2-3 мм.
Приготовленный мазок подсушивают на воздухе, после чего на его поверхности углом предметного стекла или грифельным карандашом надписывают фамилию больного. Из крови каждого больного готовят не менее двух мазков.
Приготовление толстой капли
К свежевыступившей капле крови прикасаются предметным стеклом три раза подряд, причем так, чтобы каждая капля отстояла на некотором расстоянии от другой. Углом чистого предметного стекла расширяют капли. Затем препарат подсушивают на воздухе в течение 1-2 часов и маркируют его карандашом по стеклу или специальными чернилами.
Окраска и фиксация мазков крови
До окраски мазки крови необходимо зафиксировать: 1) метиловым алкоголем в течение 3 минут, 2) абсолютным этиловым спиртом - 5 минут, 3) чистым ацетоном - 5 минут, 4) смесью Никифорова (равные объемы 96° этилового сппрта и эфира) - 10-15 минут или 5) фиксатором Май-Грюнвальда в течение 3 минут.
Фиксацию препаратов крови производят следующим образом. В широкогорлую банку с притертой пробкой, в которую налит один из фиксаторов, устанавливают предметные стекла, сложенные попарно мазками наружу (рис. 30). При большом количестве мазков крови каждую пару предметных стекол захватывают кусочками разрезанной по длиннику полой резиновой трубки, что предотвращает соприкосновение мазков друг с другом. По истечении времени фиксации предметные стекла захватывают пинцетом Корне, располагают на мостике мазками кверху на небольшом расстоянии друг от друга. Мостик монтируют из двух одинакового диаметра и длины трубок или пипеток, которые соединяют между собой резиновой трубкой (расстояние между параллельно расположенными стеклянными трубками должно быть 5-6 см).
Для окрашивания фиксированных препаратов крови применяется краска Романовского, которая готовится следующим образом: 3,8 г сухой краски растворяют в 250 мл чистого метилового или этилового спирта. Оставляют на несколько дней и периодически взбалтывают, после чего прибавляют 250 мл чистого глицерина и вновь оставляют на 3-5 дней при частом взбалтывании. В работе применяют краску Романовского, имеющуюся в продаже, которую разводят на дистиллированной нейтральной воде. Так как дистиллированная вода не всегда бывает нейтральной, ее реакцию проверяют с помощью индикаторной бумаги.
Для получения лучшей окраски пользуются буферными растворами.
Для нейтрализации воду щелочной реакции подкисляют 1% раствором уксусной кислоты. Дистиллированную воду кислой реакции нейтрализуют 1% раствором двууглекислого натрия. Результаты нейтрализации устанавливают с помощью индикаторной бумаги.
Титр краски Романовского (количество капель основного раствора краски на 1 мл дистиллированной воды) устанавливают путем окрашивания мазков крови разными разведениями краски: 1, 2 или 3 капли на 1 мл нейтральной дистиллированной воды. Для окраски одного мазка требуется 3-4 мл разведенной краски Романовского. Разведение краски производят в цилиндрах, причем краску приливают к воде и размешивают, но не наоборот. По мазку с лучшей окраской устанавливают титр краски и время окрашивания; этим титром пользуются для окрашивания препаратов крови.
Окраска мазков крови по Романовскому
Высушенные на воздухе и надписанные мазки фиксируют одним из указанных выше фиксаторов, кладут на мостики и после высыхания фиксатора покрывают на 20-25 минут разведенной по титру краской Романовского. Краску сливают, а мазки смывают водой и высушивают.
Окраска мазков крови по Нохту
Для окраски препаратов по этому методу готовят краску азур-эозин: 1 г сухой краски азур II растворяют в 1 л дистиллированной воды и 1 г водного эозина растворяют в 1 л дистиллированной воды. Растворы хранят отдельно в темном месте.
Для окраски используют смесь, состоящую из 0,5 мл раствора азура, 0,5 мл раствора эозина и 3 мл дистиллированной воды.
На фиксированный и высушенный мазок крови наливают на 20-30 минут азур-эозин, затем краску смывают: водой и высушивают мазки.
Окраска мазков крови по Лейшману
Для окраски препаратов необходима краска Лейшмана, которая продается в готовом виде, и дистиллированная вода нейтральной реакции.
На нефиксированный мазок наливают 15-20 капель, краски Лейшмана (благодаря наличию спирта в краске; происходит одновременная фиксация препарата) на 2 минуты. Пипеткой прибавляют 30-40 капель дистиллированной воды нейтральной реакции, производят смешение реактива с водой, красят 4-5 минут. Мазок промывают водой и высушивают на воздухе.
Окраска мазков крови по Крюкову-Папенгейму
Для окраски препаратов надо иметь: 1) фиксатор Май-Грюнвальда, 2) дистиллированную воду нейтральной реакции и 3) разведенную по титру краску Романовского. Для приготовления фиксатора Май-Грюнвальда 0,5 г краски (эозиновокислой метиленовой синьки) растворяют в 200 мл метилового спирта; фиксатор имеется также в готовом виде.
На нефиксированный мазок на 3 минуты наливают 10-15 капель фиксатора Май-Грюнвальда. Не сливая фиксатор, на мазок наливают 10-15 капель дистиллированной воды нейтральной реакции и выдерживают одну минуту, затем фиксатор с водой сливают и на препарат наливают разведенную по титру краску Романовского. Через 15-20 минут препарат промывают водой и высушивают на воздухе.
Окраска толстой капли крови
Толстые капли крови не фиксируют. Предметные стекла с хорошо просушенными толстыми каплями располагают па мостике на некотором расстоянии одно от другого и на 8-10 минут наливают на них краску Романовского (того же разведения, что и для окраски мазков крови). Происходит выщелачивание эритроцитов. Затем краску сливают и на препараты наливают новую порцию разведенной краски Романовского на 20-30 минут. Затем осторожно, чтобы не смыть, капли, предметные стекла ополаскивают водой и высушивают.
