Система гаптоглобина

Сывороточный белок гаптоглобин (Нр) был открыт в 1938 г. М. Polonowski и М. F. Jayle. О. Smithies (1955) доказал существование трех типов Нр, а в том же году О. Smithies и R. Н. Walker на основании посемейных обследований доказали и их генетическую обусловленность. Авторы предложили генетическую модель наследования трех типов Нр, согласно которой два аутосомальных кодо минантных аллеля Нр1 и Нр2 в едином генном локусе Нр контролируют появление трех фенотипов Нр: Нр1-1, Нр2-1 и Нр2-2. Фенотипы Нр1-1 и Нр2-2 генотипически гомозиготны по соответствующим аллелям (Нр1/Нр1 и Hp2fHp2), а фенотип Нр2-1 генотипически гетерозиготен (Нр'/Нр2).

Многочисленные семейные обследования, проведенные в ряде стран среди различного в расовом отношении населения, в основном подтвердили правильность этой генетической гипотезы. Однако в настоящее время накопилось много новых данных и наблюдений, требующих создания новой формально генетической модели наследования групп гаптоглобина.

Гаптоглобин является а2-гликопротеином, в норме в крови содержится около 10 г/л, он составляет приблизительно 25–30% всей аг-протеиновой фракции и 1–2% всех сывороточных белков, причем нормальная концентрация этого белка может значительно колебаться. Для судебных медиков существенным является то, что при обычной электрофоретической технике определения типов гаптоглобина в крахмальном геле можно четко определить типы этого белка только в том случае, если его уровень в сыворотке составляет не менее 4 г/л. При концентрации 1,5 г/л и ниже определение типов гаптоглобина вообще едва ли возможно. Во всех этих случаях возникает опасность для экспертов – можно неправильно диагностировать истинную генетически обусловленную агаптоглобинемию. Количественное определение гаптоглобина в сыворотке свидетельствует о том, что при типе Нр2-2 его содержание почти всегда ниже, чем в сыворотке лиц с типом Hpl-il. Судебно-медицинский эксперт всегда должен четко представлять, что приблизительно у 90% новорожденных в сыворотке крови гаптоглобина нет (так называемая физиологическая агаптоглобинемия), однако в 3–4-месячном возрасте тип этого белка, как правило, уже можно установить.

G. Е. Connell и соавт. (1962) при редуцированном расщеплении очищенного гаптоглобина меркаптоэтанолом в присутствии 8 М мочевины выделили две молекулярные цепи – аир. Авторы смогли доказать, что p-цепь не является генетически вариабельной, хотя она ответственна за образование гаптоглобина, а a-цепь генетически вариабельна и в зависимости от действия того или иного аллеля (Нр1 или Нр2) трансформируется соответственно в a1- или а2-цепь.

Белок Нр1 при обычном электрофорезе в крахмальном геле мигрирует к аноду как один компонент, обладающий высокой электрофоретической подвижностью. Белки Нр2-1 и Нр2 образуют несколько зон с различной скоростью миграции (рис. 5). А. С. Allison (1959) объясняет это тем, что белки Нр2 могут полимеризоваться.

Рис. 5. Фореграммы трех стандартных типов гаптоглобина (Нр1-1т Нр2-1, Нр2-2) и трех атипичных его вариантов (Нр2-1М, HpJ-1 и НрСа), выявляемых с помощью электрофореза в крахмальном геле. Цифрами 1–7 обозначены соответствующие фракции Нр.

В настоящее время установлено, что генный локус Нра, контролирующий весь полиморфизм системы Нр, располагается на хромосоме 16.

Методики определения типов гаптоглобина

Качественное определение типов гаптоглобина в основном проводят с помощью электрофореза в крахмальном геле.

При применении методики, разработанной О. Prokop и G. Bundschuh (1963), используют щелочную боратную систему. Готовят гелевый буфер: 4,63 г Н3ВО3 и 3,33 г NaOH на 5 л дистиллированной воды, pH 11. Перед непосредственным употреблением основной раствор разводят дистиллированной водой в соотношении 1:1. Готовят электродный (переходный) буфер: 37,2 г Н3ВО3 и 4,8 г NaOH на 2 л дистиллированной воды.

При электрофорезе с прерывистой буферной системой по М. Poulik (1957) используют трис-цитратный буфер. Состав буферной системы следующий. Гелевый буфер: 076 М трис, 0,005 М лимонная кислота, pH 8,6; электродный буфер: 0,3 М Н3ВО3, 0,06 М NaOH, pH 8,6. С помощью этой системы достигается значительно лучшее разделение фракций гаптоглобина, поэтому ее всегда следует применять для изучения редких вариантов белка, а также во всех случаях, когда у эксперта возникают сомнения в отношении типа гаптоглобина. К недостаткам этого метода следует отнести невозможность использования «многорядных» крахмальных блоков, поскольку при указанной величине pH гелевого буфера различные сывороточные белки мигрируют в направлении как анода, так и катода.

Для определения типов гаптоглобина используют также электрофорез на бумаге, агаровом геле, в геле полиакриламида.

Генетические концепции наследования типов гаптоглобина

Несмотря на то, что начиная с 1959 г. в генном локусе системы Нр были с достоверностью открыты новые аллели, для практического использования этой системы в судебно-медицинских экспертизах спорного происхождения детей до самого последнего времени было достаточно трех ее основных стандартных фенотипов (Нр1-1, Нр2-1, Нр2-2). Их появление обусловлено действием аллеля Нр2 согласно первоначально предложенной О. Smithies и R. Walker (l956) двуаллельной модели наследования групп гаптоглобина. Дело в том, что среди белого европеоидного населения частота встречаемости всех атипичных вариантов гаптоглобина, обусловленных действием новых аллелей в генном локусе системы гаптоглобина, благодаря их крайней редкости чрезвычайно мала и в какой-то степени ею можно пренебречь. Большинство таких вариантов можно выявить с помощью обычного электрофоретического разделения. Гораздо труднее обнаружить редкий аллель Нр° в гетерозиготной форме с одним из основных аллелей Нр1 или Нр2. Частота встречаемости аллелей Нр1 и Нр2 среди европеоидов, монголоидов и негроидов составляет соответственно 35–65, 20–80 и 45–55%.

Благоприятная в плане информативности частота встречаемости основных аллелей Нр1 и Нр2 среди населения Земного шара делает эту систему Нр особенно ценной при использовании ее в судебно-медицинских экспертизах спорного отцовства. Вероятность исключения мужчины, не являющегося биологическим отцом ребенка и фигурирующего в процессе в качестве ответчика, при использовании только одной системы Нр составляет для европеоидных популяций 18%, негроидных и монголоидных популяций соответственно 18,73; и 15,96%. G. Е. Connell и соавт. (.1962) доказали, что a1-гаптоглобиновая фракция неоднородна. Авторы установили подтипы в двуаллельной модели. С помощью вертикального электрофореза в мочевинно-крахмальном геле авторы смогли показать существование двух a1-цепей гаптоглобина: HplFa (быстромигрирующая) и HplSa (медленно мигрирующая). Посемейные обследования, проведенные этими исследователями, свидетельствовали о том, что появление двух различных полипептидных цепей Нр обусловлено действием двух различных аллелей HplF и Hp2s в аутосомальном кодоминантном генном локусе системы Нр. Полипептидные цепи HplFa и HplSa различались лишь по набору аминокислот.

На основании проведенных исследований была предложена новая трехаллельная генетическая модель наследования типов гаптоглобина.

Аллели HplF, Нр15, Нр2.
Генотипы Нр*/Нр*, Hp's/Hpis, Нр”  
НрУНр2.  
Фенотипы HplF-HplF, HplS-tHplS, HplF-HplS, Hp2-1F, Нр2-1й Hp2-2.

По современной теории наследования групп гаптоглобина в аутосомальном кодоминантном генном локусе системы Нр из-за частичной генной дубликации в результате негомологичного перекреста хромосом существует по меньшей мере пять «стандартных» аллелей: Hp1F, Hpls, Hp2FF, Hp2SS, Нр2 (или Hp2^s) для Hp2FS и Hp2SF), обусловливающих появление не менее 15 генотипических комбинаций, антигенно реализующихся появлением 15 различных фенотипов этой системы:

Частота встречаемости аллелей Hp1F и Hpls среди европейского населения примерно одинакова и составляет 15-20%.

Агаптоглобинемия

Впервые доказательства в пользу существования генетически обусловленной агаптоглобинемии у человека представили Н. Harris и соавт. (1958). Они сообщили о двух белых семьях, у членов которых довольно часто наблюдался фенотип НрО и была отмечена несовместимость пар мать – ребенок. Эти наблюдения авторы объяснили тем, что в этих семьях либо имеется аллель Нр°, либо передается по наследству какой-то измененный или супрессорный ген, тормозящий синтез гаптоглобина. Еще более удивительные данные представили Е. Matsunaga и соавт. (1970). Они описали японскую семью, в трех поколениях которой один раз наблюдалась несовместимость по типам Нр (противоположная гомозиготность) у матери и ребенка и два раза – такая же несовместимость по типам Нр у ребенка и отца.

Перепутывание детей при рождении, а также их «незаконнорожденность» в обоих случаях полностью исключались на основании других обширных генетических исследований. Объясняя этот феномен, авторы также выдвинули гипотезу о наличии аллеля Яр0, который в паре с аллелем Яр1 давал не полностью совпадающую картину фенотипа Нр1-1, а в паре с аллелем Нр2 – нормальный или резкоослабленный фенотип Нр2-2.

О подобных находках противоположной Нр-топозиготности между родителем и ребенком, когда их «родство» не вызывало никакого сомнения, сообщали и другие авторы.

Эти обстоятельства постоянно должен учитывать судебно-медицинский эксперт при исключении отцовства (материнства) по противоположной Яр-гомозиготности. Действительно, если отец ребенка имеет генотип Яр°/Яр1, мать – Нр2/Нр2 , а ребенок – Яр2/Яр°, то в данном случае возможность сделать ошибочное исключение отцовства чрезвычайно велика, поскольку гетерозиготные генотипы отца и его ребенка ошибочно трактуются как противоположно гомозиготные. Поэтому во всех случаях исключения отцовства по противоположной Нр-гомозиготности эксперт обязан:

• провести возможно максимальное исследование генетических маркеров других изосерологических, сывороточных и ферментных систем с целью подтверждения невозможности ответчика быть отцом ребенка;
• в случае «неисключения» отцовства по всем другим исследованным серологическим признакам исследовать кровь ответчика на наличие типов Нр. Например, исключение ответчика по противоположной Яр-гомозиготности. Ответчик имеет фенотип Нр1-1, мать и ребенок – Нр2-2. Для предотвращения ошибочного исключения отцовства (генотипы ответчика, матери и ее ребенка соответственно Яр°/Яр1, Яр2/Яр2 и Яр°/Яр2) исследуют типы Нр родителей ответчика. Если оба родителя имеют тин Нр2-1, то эксперт должен исключить ответчика в качестве отца ребенка;
• провести повторное исследование крови ответчика, матери и ее ребенка на наличие типов Нр с обязательным включением контрольных образцов НрМ и Нр2-2. При этом необходимо учитывать малейшее отклонение гаптоглобиновых фракций «контрольного» Нр1-1 и Нр1-1 ответчика и ребенка, а также интенсивность выраженности гаптоглобиновых фракций (особенно в Нр2ч2) в контрольных и исследуемых образцах крови.    

Среди европеоидных популяций случаи истинной генетически обусловленной агаптоглобулинемии (Ahp) чрезвычайно редки, поэтому вероятность ее обнаружения при проведении экспертиз в делах о спорном происхождении детей также мала. Гораздо чаще истинная Ahp или фенотип НрО наблюдается у негров, особенно в семьях, члены которых имеют особый вариант Нр – так называемый модифицированный Hp2-1, или Нр2-1 mod, или Нр2-1М.

Редкие атипичные типы гаптоглобина

К ним относят фенотипы Нр2-1М, HpJ-1 (Johnson) и другие.

Фенотип Hp2-1M. Е. R. Giblett (1959) описала у негроидной популяции необычный фенотип Нр, который благодаря близости величины электрофоретической подвижности к таковой стандартного Нр2-1 был назвав Нр2-1 mod, или Нр2-1М. Этот тип (см. рис. 5) характеризуется интенсивными двумя первыми быстро мигрирующими Нр-фракциями (фракции 1 и 2) и значительно менее интенсивными и медленно мигрирующими Нр-фрак- тщями. Число последних у Нр2-1М меньше, чем у Нр2-1. По выраженности медленных Нр-фракций тип Нр2-1М -очень трудно отличить от «нормального» типа Нр2-4. Результаты многочисленных семейных обследований свидетельствуют о генетической обусловленности типа Нр2-1М и его наследственной передаче.

Тип Нр2-1М чрезвычайно редок среди европеоидов, до настоящего времени описаны только три белые семьи, для которых была доказана наследственная передача типа Нр2-1М. Среди неевропеоидных популяций, особенно среди негров, тип Нр2-1М распространен довольно широко.

Фенотип HpJ-1 (Johnson) впервые был описан Е. R. Giblett (1959) у негритянской женщины и ее дочери. Затем этот фенотип наблюдали в различных расах и популяциях, несмотря на то что он встречается довольно редко. При электрофорезе в крахмальном геле разделяется на хорошо выраженную фракцию 1, фракции 2–6 сдвинуты к катоду (уменьшение скорости миграции этих фракций совершенно такое же, как и при разделении Нр2н1) и фракции 1 и 2 разделяются на два компонента (см. рис. 6). Иногда наблюдается появление добавочных фракций, отсутствующих при электрофорезе Нр1-1, Нр2-2, Нр2-1 и Нр2-1М.

Тип Johnson не является модификацией типа Hp2-1 (как рассматривали его ранее, прежнее название Hp2-1J). Исследование диссоциированных a-цепей показало, что» этот тип, очевидно, обязан своим происхождением аллелям Нр3 и Hpls. О. Smithies и соавт. (1962) предположили,, что причиной появления аллеля НрJ явилась генная трипликация посредством кроссинговера между двумя Нр2-генами при передвинутом синапсе. Поэтому на основании теории эволюционного развития аллелей Нр2 теоретически можно допустить возможность появления восьми вариантов гена.

Другие варианты гаптоглобина

F. Gala tius-Jensen (1958) описал новый необычный фенотип гаптоглобина – Нр Carlsberg (Нр-Са), который по интенсивности, числу и скорости миграции Нр-фракций почти не отличался от обычного фенотипа Нр2-1, однако его фракция 2 отчетливо расщеплялась (см. рис. 5). Позднее этот тип был описан другими авторами. Относительно высокая частота встречаемости Нр-Са у членов одной семьи в различных поколениях свидетельствовала о генетической обусловленности этого типа.

Согласно исследованиям Е. R. Giblett (1964), фенотип Нр-Са характеризуется уменьшенной генетической реализацией (генетическим продуцированием) генпродукта Нр1.

W. С. Parker и A. G. Bearn (1963) выдвинули генетическую концепцию наследования типа Нр-Са, согласно которой своим происхождением он обязан генному комплексу, состоящему из нормальных аллелей Нрх и Нр2 и измененного (в результате неравномерного кроссинговера между генными локусами Нр1 и Нр2) аллеля Нр2.

О других вариантах гаптоглобина упомянем лишь вкратце.

Типы гаптоглобина Нр2-1 (trans) и Нр2-1 (Haw)

Они характеризуются усиленной продукцией генпродукта Нр1 в обычном гетерозиготном фенотипе Нр2-1. Их генетическая наследственная передача изучена еще недостаточно.

Иммуногенетические варианты гаптоглобина

При изучении гаптоглобина с помощью иммуногенетических методов были открыты ранее неизвестные его свойства. Вначале считали, что все три обычных стандартных типа гаптоглобина (Нр1, Нр2-1 и Нр2-2) иммунологически идентичны. Однако впоследствии были обнаружены различные антигенные детерминанты гаптоглобина. К. Eichmann и соавторы (1966) характеризовали их следующим образом.

Антигенная детерминанта А обнаруживается во всех трех стандартных типах гаптоглобина и комплексе Нр – НЬ. Антигенная детерминанта В выявляется во всех трех стандартных типах гаптоглобина, если они не связаны в комплекс с гемоглобином. Антигенная детерминанта С имеется в типах Нр2-2 и Нр2-1, но отсутствует в типе Нр1-1. В дальнейшем были выявлены дополнительные антигенные детерминанты гаптоглобина, которые независимо от комплекса Нр–НЬ определяют, по-видимому, антигенный полиморфизм (3-цепей гаптоглобина, до последнего времени считавшихся генетически монбморфными.

Интересно отметить, что существуют некоторые генетически обусловленные варианты гаптоглобина, которые могут быть выявлены не электрофоретическими, а только иммунологическими методами. К ним следует отнести варианты Нр Marburg и Нр Bellevne. Оба варианта имеют погашенное «сродство» к гемоглобину (сниженную Hb-связывающую способность) и являются мутантами (i-цепей гаптоглобина.

Итак, сывороточная система гаптоглобина, как и многие генетически обусловленные системы крови человека, является исключительно полиморфной, а следовательно, весьма ценной для судебно-медицинской экспертизы в делах о спорном происхождении ребенка. Даже с учетом двуаллельной модели наследования групп гаптоглобина процент исключения мужчин, ложно указанных в качестве отцов того или иного ребенка, из-за большой частоты встречаемости аллелей Нр1 и Нр'2 достаточно высок. Дальнейшее совершенствование методов электрофоретического анализа и широкое внедрение их в экспертную практику в ближайшее время, несомненно, расширят судебно-медицинские возможности при использовании системы гаптоглобина в подобного рода экспертизах. Электрофоретическое выявление генетически обусловленной неоднородности фракций Нр1аь и Hplus позволит использовать уже не три, а шесть возможных генотипических комбинаций гаптоглобина, по которым можно будет более конкретно судить о возможности или невозможности рождения ребенка от определенной родительской пары.