Определение билирубина в крови

Определение билирубина в крови по методу Бакальчука

Оснащение рабочего места

1. Штативы.
2. Химические пли серологические пробирки.
3. Градуированные пипетки на 1-10 мл.
4. Сульфаниловая кислота [парасульфаниловая кислота C6H4(N2H)S03H • 2Н20].
5. Концентрированная соляная кислота.
6. Азотистокислый натрий (NaN02).
7. Поваренная соль.
8. Спирт этиловый 96°.

Сущность метода

Под влиянием диазотированной сульфаниловой кислоты билирубин распадается на два дипиролловых остатка, дающих азокрасящее вещество розовато-фиолетового цвета. Билирубин, связанный с глюкуроновой кислотой, с диазореактивом Эрлиха дает окрашивание без предварительной обработки его спиртом, в связи с чем эту реакцию называют прямой. На этом наблюдении основан метод Бакальчука.

Свободный билирубин дает окрашивание с диазореактивом лишь после предварительной обработки его спиртом, который осаждает белок. Исходя из этого, получающуюся реакцию называют непрямой. Для проведения исследования требуются следующие реактивы:

1. Диазореактив Эрлиха № 1: 1 г сульфаниловой кислоты разводят в небольшом количестве воды в колбе на 1 л, добавляют 15 мл концентрированной соляной кислоты удельного веса 1,19, смешивают и доливают водой до метки. Реактив хранится в темной и хорошо закупоренной склянке; годен в течение 2 месяцев.
2. Диазореактив Эрлиха № 2 (0,5% раствор азотистокислого натрия): 0,5 г NaNCb растворяют в мерной колбочке на 100 мл в 60-70 мл дистиллированной воды и доливают водой до метки (реактив годен в течение 1-2 недель).
3. Смесь диазореактивов Эрлиха: перед работой смешивают 8 мл диазореактива Эрлиха № 1 и 0,25 мл диазореактива Эрлиха № 2. Реактив имеет специфический запах.
4. Физиологический раствор (0,85%). Готовят в день постановки исследования.

Техника определения

В штатив ставят 11 нумерованных химических или серологических пробирок и во все пробирки, кроме первой, помещают по 0,5 мл физиологического раствора. В первую и вторую пробирки наливают по 0,5 мл испытуемой сыворотки и, начиная со второй пробирки, переносят из пробирки в пробирку по 0,5 мл смеси сыворотки с физиологическим раствором, каждый раз смешивая внесенный раствор с содержимым пробирки; из последней пробирки 0,5 мл смеси выливают. Таким путем в пробирках получают разведения сыворотки соответственно в 2, 4, 8, 16 раз и т. д. Затем во все пробирки, кроме первой, приливают по 0,5 мл смеси диазореактивов Эрлиха и по 0,5 мл 96° этилового спирта, пробирки встряхивают в течение 2-3 минут и оставляют на 10 минут при комнатной температуре. В первую пробирку наливают 0,5 мл смеси диазореактивов Эрлиха, смешивают ее содержимое и переходят к учету реакции.

В первой пробирке учитывают реакцию на прямой билирубин. В зависимости от времени появления розовато-фиолетового окрашивания различают три вида реакции: 1) прямую быструю реакцию — окраска появляется тотчас после прибавления диазореактива; 2) прямую замедленную реакцию — окраска появляется в течение 10 минут; 3) прямую двухфазную реакцию — окраска, вначале слабая, в течение нескольких минут приобретает более интенсивный оттенок.

Если же содержимое пробирки по истечении 10 минут не окрашивается, то реакция отрицательная. Общий билирубин учитывают в остальных 10 пробирках. Количество билирубина определяют по последней пробирке, в которой ясно видно слабое розовато-фиолетовое окрашивание. Количество билирубина в этом разведении сыворотки равно 0,16 мг в 100 мл сыворотки, т. е. 0,16 мг%. Для расчета количества билирубина в цельной сыворотке 0,16 умножают на степень разведения сыворотки и получают количество билирубина в миллиграмм- процентах.

Пример расчета

Слабое розовато-фиолетовое окрашивание получилось в шестой пробирке. Расчет ведут по этой пробирке, в которой получено разведение в 32 раза. Отсюда 0,16X32 = 5,12 мг% билирубина.

Чтобы не производить расчета, используют следующую таблицу:

Если несколько последних пробирок имеют одинаковую окраску, то берут первую из одинаково окрашенных пробирок, учитывают ее разведение и умножают на 0,16.

Определение билирубина по методу Ван ден Берга (в модификации Братковского и Канторовича)

Оснащение рабочего места

1. Штативы.
2. Пробирки.
3. Микропипетки.
4. Градуированные пробирки.
5. Мерная колба на 100 мл.
6. Диазореактив Эрлиха № 1.
7. Диазореактив Эрлиха № 2.
8. Лимонная кислота.
9. Двузамещенный фосфорнокислый натрий (Na2HP04 • 2Н20).
10. Нитрат кобальта [Co(N03)2 • 6Н20].
11. 96° этиловый спирт.
12. Сернокислая медь (CUSO4).

Сущность метода

Метод основан на том же принципе, что и метод Бакальчука.

Для постановки исследования необходим стандартный цветной ряд пробирок, который готовят следующим образом: 4,4 г азотнокислого кобальта [Со (N03)2 • 6Н2О] и 1 г сернокислой меди растворяют в 10-20 мл воды; полученный раствор фильтруют в мерную колбу емкостью 100 мл и доводят водой до метки. Нитрат кобальта можно заменить 2,3 г прокаленного кобальта сернокислого (C0SO4 • 7НгО), свободного от солей никеля. Полученный раствор разводят, в результате чего получают ряд пробирок, окраска которых соответствует определенному содержанию билирубина (в миллиграмм-процентах) в сыворотке крови (см. приведенную ниже схему).

Схема приготовления стандартного цветного ряда для определения билирубина

В 9 пробирок одного диаметра и высоты наливают по 5 мл каждого из приготовленных разведений раствора, плотно закрывают их корковыми пробками и парафинируют. На каждой пробирке обозначают концентрацию раствора, соответствующую содержанию билирубина в миллиграмм-процентах.

Для данного метода необходимы следующие реактивы:

1. Диазореактив Эрлиха № 1 и 2 (приготовление см. «определение билирубина в крови по методу Бакальчука»).
2. Буферный спиртовой раствор: 0,289 г лимонной кислоты растворяют в небольшом объеме дистиллированной воды; после растворения прибавляют 1,29 г двузамещенного фосфата натрия (NasHP04 2НгО); полученный раствор переливают в мерную колбу емкостью 500 мл, добавляют 150 мл дистиллированной воды и 250 мл 96° этилового спирта, а затем доводят водой до метки. рН раствора равен 6,6; реактив стоек.

Техника определения

Берут пробирку точно такой же высоты и диаметра, как и пробирки стандартного цветного ряда, в нее наливают 0,1 мл сыворотки крови и 0,2 мл смеси диазореактивов и тщательно смешивают. Через 5 минут приливают 0,2 мл дистиллированной воды и 0,5 мл буферного спиртового раствора, оставляют пробирку на 15 минут, затем учитывают реакцию, сравнивая цвет смеси в пробирке со стандартным цветным рядом на белом фоне в отраженном свете. Для определения количества билирубина берут из ряда пробирок ту, цвет которой совпадает с цветом жидкости в исследуемой пробирке. Например, цвет жидкости в пробирке, содержащей исследуемую сыворотку, совпадает с цветом пятой пробирки стандартного ряда. Количество билирубина (согласно схеме) равно 2 мг%.

Определение билирубина по методу Иендрашика

Оснащение рабочего места

1. Штативы.
2. Серологические пробирки.
3. Градуированные пипетки на 1-10 мл.
4. Колбочки на 100 и 250 мл.
5. Электрическая печка.
6. Фотоэлектроколориметр.
7. Кофеин.
8. Бензойнокислый натрий (или Cofleini natrii benzoici).
9. Билирубин.
10. Поваренная соль.
11. Едкий натр.
12. Углекислый натрий (Na2C03).
13. Ледяная уксусная кислота.
14. Сульфаниловая кислота.
15. Концентрированная соляная кислота.
16. Азотистокислый натрий (NaN02).

Сущность метода

Принцип метода тот же, что и метода Бакальчука. В связи с тем что кофеин и бензойнокислый натрий повышают растворимость непрямого билирубина, последний взаимодействует с диазореактивами Эрлиха без добавления спирта.

Для этого метода необходимы следующие реактивы:

1. Кофеиновый реактив: 1 г чистого кофеина, 1,5 г бензойнокислого натрия и 2,5 г уксуснокислого натрия помещают в мерный цилиндр на 200 мл, растворяют при легком нагревании в 100—150 мл воды и по растворении доливают дистиллированной водой до метки. Вместо чистого кофеина и бензойнокислого натрия можно использовать 2,64 г кофеин-бензоата натрия (К. М. Сулло).
   Срок хранения реактива в холодильнике от 10 до 14 дней.
2. Диазореактив № 1: в колбочку на 100 мл наливают необходимое количество воды и растворяют 1 г сульфаниловой кислоты, прибавляют 5 мл концентрированной соляной кислоты и доливают дистиллированной водой до метки.
3. Диазореактив № 2: 0,5% раствор азотнокислого натрия (приготовление см. «Определение билирубина в крови по методу Бакальчука»).
4. 0.9% раствор хлористого натрия.
5. 30% раствор едкого натра (NaOH).

Техника определения

В штатив устанавливают три пробирки, нумеруют их и в каждую пробирку разливают реактивы в следующей последовательности.

Содержимое пробирок тщательно смешивают и оставляют на 10 минут, после чего в каждую пробирку наливают по 3 капли 30% раствора едкого натра. Растворы в пробирках окрашиваются в зеленый цвет. При интенсивной окраске содержимое всех трех пробирок разводят водой и учитывают разведение при расчете.

Концентрацию билирубина определяют с помощью фотоэлектроколориметра. Колориметрируют против воды, в кюветах с расстоянием рабочих граней 0,5 см, с красным светофильтром, на правом барабане.

Вначале колориметрируется контроль (пробирка № 3), а затем жидкость, находящаяся в пробирках № 1 и 2. Из полученных при колориметрировании содержимого пробирок № 1 и 2 экстинкций вычитают экстинкцию, полученную при колориметрировании контроля, а затем по калибровочной кривой определяют уровень общего и прямого билирубина.

Количество непрямого билирубина рассчитывают путем определения разницы между количеством общего и прямого билирубина.

Результаты исследования оформляют в бланке анализа. В норме билирубина в крови 0,2-1 мг%.