Применение аппарата Варбурга
Энзиматические процессы (так же как и химические) протекающие с потреблением или выделением газов, можно количественно проанализировать с помощью манометрических методов. Эти методы используют, для оценки подобных изменений, колебания давления, возникающие в реакционной системе, находящейся при постоянной температуре. В течение определений, объем можно изменять или его можно поддерживать постоянным. В случае применения методов с непостоянным объемом, расчеты более трудоемки по сравнению с определениями производимыми при постоянном объеме.
Классическая модель аппарата Варбурга позволяет определить расход или образование газов, которое может иметь место в закрытой реакционной системе, посредством манометрического отображения колебаний давления в системе с постоянным объемом и температурой.
Манометр аппарата (рис. 61) состоит из капиллярной трубки в виде U разветвления которой градуированы в миллиметрах (обычно от 0 до 30(У). У нижнего изгиба капиллярной трубки находится штуцер, к которому приспосабливается короткая резиновая трубка наполненная жидкостью Бродье. Правое разветвление капиллярной трубки свободное.
Рис. 61. Манометр аппарата Варбурга. А – схема; В – установленный на подставке.
Левое разветвление непосредственно сообщается с реационным сосудом, а косвенно – через кран с внешней средой. Все приспособление установлено на металлической подставке, оборудованной на нижней части, на уровне резиновой трубки приспособленной к штуцеру-системой сжимания резиновой трубки, допуская таким образом повышение или понижение уровня жидкости в манометре.
Реакционный сосуд (рис. 62) в виде колбы Эрленмейера (небольшой емкости около 15 см), имеет внутри на дне небольшой приваренный тигель (емкость около 1 см), а сбоку расположен штуцер (емкостью около 3 см). На некоторых конструкциях аппарата боковой штуцер приварен. В других он прикрепляется с помощью обычного шлифа. Связь между реакционным сосудом и манометром также осуществляется при помощи шлифа.
Рис. 62. Реакционные сосуды аппарата Варбурга (с неподвижным боковым разветвлением).
Аппарат Варбурга оснащен также механическим узлом, с одной стороны обеспечивающим поддержание постоянной температуры в водяной бане, в которую погружают реакционный сосуд, а с другой вызывает непрерывное встряхивание всей системы (манометр и реакционный сосуд).
В реакционный сосуд вводят анализируемую систему (в основном надо стараться, чтобы общий ее объем равнялся 3 см кубических). В боковой штуцер можно вводить то или иное вещество (антибиотик, медикамент, химическое вещество), действие которого на реакционную систему желают проанализировать.
Во внутренний тигель в случае, если при опыте необходимо устранить влияние углекислоты (образующейся во время дыхания) вводят водный раствор NaOH или КОН 10-20%.
Приспособленный к манометру реакционный сосуд может содержать точно определенный объем газа, в случае, если закрыть кран сообщения с внешней средой, расположенный на левом разветвлении капиллярной трубки. Этот объем содержит: емкость реакционного сосуда (включительно штуцер) и капиллярной трубки, начиная с места ее соединения с реакционным сосудом и до уровня жидкости Бродье.
Любой расход (образование) газа внутри этого объема ведет к спадению (росту) давления в соответствующем пространстве и, следовательно, к повышению (снижению) уровня жидкости Бродье в левом разветвлении. Денивелирование в этом разветвлении капиллярной трубки происходит за счет уровня жидкости Бродье в правом разветвлении (открытом). Для отсчета денивелирования предварительно необходимо привести к постоянному объему пространство, предназначенное для реакционной системы, что осуществляют с помощью системы сжимания резиновой трубки, повышая или понижая таким образом уровень жидкости до исходной точки (считаемой нулевой точкой). Затем отсчитывается разница в уровне между левым и правым разветвлениями.
Подготовка аппарата Варбурга для опыта. Первая операция, необходимая для наладки аппарата состоит в определении точного объема закрытого пространства (реакционный сосуд, его штуцер и капиллярная трубка у нулевой точки). Обычно это определение произодят наполняя пространство ртутью, точно взвешивая количество использованной ртути и деля полученное значение на удельный вес ртути (1355 при 18°). Получаемый результат представляет собой пространство занятое газом в реакционной системе, которое в случае если вес ртути выражен в г, представляет собой число см3.
Аналогичным образом в случае если « нулевая» точка на делениях манометра изменяется, то можно определить емкость одного деления капиллярной трубки. Для этого наполняют ртутью известное число делений капиллярной трубки, точно взвешивают использованное количество ртути, а полученное значение делят как на удельный вес ртути, так и на число делений, на которых производилось определение.
После этих предварительных измерений приступают к монтажу аппарата Варбурга для произведения опыта.
Предварительно все стеклянные узлы выдерживают в сульфохромовой смеси в течение 24–48 часов, затем обильно промывают водопроводной водой, хорошо споласкивают дистиллированной водой и тщательно высушивают. Сушку можно производить или непосредственно в термостате при 105°С или промыванием этанолом и затем эфиром с последующей сушкой в термостате.
После высушивания, резиновую трубку, наполненную жидкостью Бродье надевают на нижный штуцер капиллярной трубки.
Жидкость Бродье имеет следующий состав:
таурохолат натрия 5 г
хлористый натрий 23 г
дистиллированная вода 500 мл
концентрированный спиртной раствор тимола 10 капель
раствор метиленовой сини 10% 5 мл.
Так как удельный вес жидкости Бродье составляет 1,034, столбик этой жидкости высотой в 10 000 мл соответствует столбику 760 мл Hg.
Затем к манометру приспосабливают – при смазывании достаточно консистентным вазелином – кран, допускающий сообщение левого разветвления капиллярной трубки с внешней средой. Кроме того смазывают также шлиф, обеспечивающий связь между манометром и реакционным сосудом. Таким образом, подготовленный манометр устанавливают на штатив.
Таким же образом поступают со всеми остальными манометрами аппарата.
Реакционные сосуды приспосабливаются к манометру после того, как в них ввели ингредиенты, образующие реакционную систему.
Тем временем нагревают водяную баню и устанавливают желаемую температуру для проведения реакции. После этого в баню погружают установленные на манометрах реакционные сосуды и приводят в действие систему для встряхивания манометра. Встряхивание продолжают приблизительно в течение 15 минут, обеспечивая таким образом получение в реакционной системе существующей в бане температуры.
В этот момент систему встряхивания выключают, заботясь о том, чтобы манометры остались в вертикальном положении. С помощью системы сжимания резиновой трубки жидкость Бродье устанавливают на «нулевой» точке. Затем закрывают кран на левом разветвлении, осуществляющий связь с внешней средой. Систему встряхивания снова включают, причем этот момент считается началом проведения опыта.
Отсчет изменений происходящих в давлении газа присутствующего в реакционной системе производят по истечении определенных промежутков времени, в зависимости от условий опыта. Для отсчета поступают следующим образом:
- выключают приспособление для встряхивания, причем манометры остаются в вертикальном положении;
- уровень жидкости Бродье в левом разветвлении доводят до «нулевой точки»;
- отсчитывают разницу уровня жидкости между левым и правым разветвлениями;
- производят коррекцию небольших колебаний внешнего давления и температуры с помощью манометра, используемого в качестве термобарометра. Этот последний содержит в реакционном сосуде те же ингредиенты что и остальные манометры, с тем различием, что ингредиенты были предварительно подвергнуты инактированию (путем нагревания). Таким образом, установленные на этом манометре денивелирования происходят лишь за счет колебаний внешней температуры или давления. К значению, отмеченному на этом манометре следует добавить или вычесть значение отсчитанное на остальных манометрах, учитывая направление денивелирования.
Для оценки в мм* количества газа израсходованного или производимого в реакционной системе пользуются уравнением:
х = h • С
где: h – отсчитанное на манометре денивелирование (в мм жидкости Бродье);
С – постоянная соответствующего манометра.
Постоянную С получают с помощью формулы Баркрофт-Варбурга.
Значения коэффициента Бунсена в этой формуле были определены эмпирически, причем они приводятся для кислорода, азота и углекислоты при температурах от 20–40°С в таблице XLVI.
Для наглядности в качестве примера использования аппарата Варбурга ниже приводится метод определения активности пировиноградной карбоксилазы и карбоновой ангидразы, поскольку обе катализируют реакции, выделяющие углекислоту.
Пировиноградная карбоксилаза является а-кетокарбоксилазой, вызьвающей декарбоксилирование а-кетоксилот (пировиноградной, кето- глутаровой, кетовалериновой).
Тиаминпирофосфат активирует пировиноградиую карбоксилазу, вследствие чего считается коферментом энзима (Энгельгардт и Канопкате).
Для определения активности того или иного препарата, содержащего этот энзим в реакционный сосуд вводят 1 мл пирувата 0,1 м в буферном цитратном растворе 0,1 м с pH 6,0 и 1 мл дистиллированной воды, или водные растворы сульфата магния 0,001 м или тиаминпирофосфата (активаторы). В боковое разветвление сосуда вводят 1 мл энзиматического препарата. В нижнюю чашку реакционного сосуда гидрат не вводят, так как определяют освободившееся количество углекислого газа.
Смешивание энзиматического препарата с субстратом произодят только после нагревания всей системы до 30°С и после того как закрывают кран сообщения манометра с внешней средой. Затем, по истечении каждых 15 минут измеряют в виде разницы по отношению к «нулевой точке» повышение уровня жидкости Бродье в правом разветвлении, когда в левом разветвлении уровень жидкости понизился до 0.
Карбоксилазной единицей считается количество энзимы, способное делить в течение 2 минут при 30°С объем в 100 мм С02.
Карбоновая ангидраза катализирует реакцию:
С02 + Н20 ^ Н2С03.
Активность этого энзима измеряют путем оценки скорости выделения С02 из бикарбонатного раствора, в присутствии энзиматического препарата. В реакционный сосуд аппарата вводят 1 мл фосфатного буферного раствора 0,2 м с pH 7 и 1 мл смеси состоящей из равных частей NaHC08 0,2 м и NaOH 0,2 м. В боковое разветвление вводят 1 мл энзиматического препарата. Внутреннюю чашу реакционного сосуда оставляют пустой. После того как температура достигает 15° в реакционном сосуде погруженном в баню с постоянной температурой, кран осуществляющий связь манометра с внешней средой закрывают, а энзим смешивают с субстратом. Этот момент является «нулевым временем». Отсчеты (повышение уровня жидкости в свободном разветвлении манометра) производят по истечении 5, 10, 15, 30, 45, 60, 90 и 120 минут. Число выделившихся во время реакции мм СО2 является числом энзиматических единиц.
