Биохимическое исследование спинномозговой жидкости

Взятие спинномозговой жидкости производится в чистые и сухие пробирки у постели больного посредством поясничной или подзатылочной пункции, проводимой соответствующим врачом.

Общая характеристика спинномозговой жидкости

1. Окраска. Нормальная спинномозговая жидкость бесцветна и прозрачна. Окраска исследуется на белом фоне вдоль оси пробирки. При некоторых заболеваниях жидкость является ксантохромной, то есть окрашенной в желто-розовый или зеленоватый цвет. Эта окраска связана с присутствием билирубина или биливердина и является показателем геморрагии центральной нервной системы или наличия застойных явлений в этой системе.

Кроме того, спинномозговая жидкость может быть также окрашена в красный цвет благодаря содержимой ею крови; присутствие крови может быть случайным, в результате связанной с пункцией травмы или может иметь патологическое значение.

2. Прозрачность. Нормальная спинномозговая жидкость прозрачна. При некоторых заболеваниях она может быть опалесцентной, гноевидной или гнойной вследствие увеличения количества фигурных элементов, фибриногена, альбумина или наличия микроорганизмов.

3. Удельный вес нормальной спинномозговой жидкости равен 1006–1008. Удельный вес увеличивается при патологических состояниях. Определение удельного веса производят специальным ареометром небольшого размера.

Примечание. Химический анализ производится только с центрифугированной спинномозговой жидкостью. Впрочем, жидкость, из которой удалены клеточные элементы, отличается большей устойчивостью и может быть обработана на следующий день без каких-либо затруднений, причем, разумеется, ее необходимо сохранять в холодильнике.

Наиболее часто проводимыми химическими анализами, представляющими интерес для диагноза и прогноза являются: реакция Панди, реакция Нонне-Аппельта, определение альбумина, глюкозы, хлоридов и мочевины, исследование триптофана и ацетона и наконец, проницаемость по отношению к нитратам и реакция с коллоидным бензолом.

Химический анализ

Реакция Панди

Принцип. Насыщенный раствор фенола дает муть с жидкостью в которой концентрация белков превышает известный предел. Это – качественная реакция на белки.

Реактив. Насыщенный раствор фенола: растворяют 10 г кристаллического фенола на 100 мл дистиллированной воды, выдерживают 24 часа в термостате при 37°, затем 2–3 дня при температуре лаборатории. На дне сосуда образуется маслянистый осадок, а прозрачная надосадочная жидкость осторожно сливается и используется как реактив.

Техника. Часовое стекло кладут на кусок черной бумаги, приливают 1 мл насыщенного раствора фенола, затем из пипетки Пастера добавляют на краю реактива 2 капли спинномозговой жидкости. Жидкость следует добавить немедленно, так как в соприкосновении с воздухом реактив образует на поверхности тонкую пленку.

Результаты.

1. Прозрачная или слегка опалесцентная жидкость = нормальная жидкость.
2. Слабая опалесцентность = +.
3. Сильное помутнение = + +.
4. Молочнообразное помутнение = + + + или + + + +.

Реакция Панди является положительной при менингитах, некоторых инфекционных болезнях, тифе, воспалении легких, прогрессивном параличе и опухолях спинного мозга. Несмотря на то, что реакция Панди весьма чувствительна, однако, отрицательная реакция не исключает возможности наличия поражения мозга, так как могут существовать случаи мозговых опухолей, энцефалита или нервного сифилиса, в которых количество белков соответствует норме.

Примечание. Спинномозговая жидкость не должна содержать крови. Все же, в случае ее присутствия жидкость центрифугируют на больших оборотах, а результат толкуется с некоторыми оговорками.

Реакция Нонне-Аппельта

Принцип. Осаждение глобулинов насыщенным раствором сульфата аммония. Это – количественная реакция на глобулины.

Реактив. Насыщенный раствор сульфата аммония. Растворяют 85 г чистого нейтрального сульфата аммония в 100 мл горячей дистиллированной воды. Оставляют на несколько дней при комнатной температуре, затем фильтруют для удаления избыточного сульфата аммония. Раствор должен иметь очень слабую щелочную реакцию (на лакмус); если раствор имеет кислую реакцию, его слегка подщелачивают, добавляя осторожно по каплям концентрированный раствор аммиака. Перед употреблением раствор фильтруют.

Техника. В гемолизную пробирку берут 1 мл жидкости, добавляют 1 мл отфильтрованного реактива, слегка встряхивают и оставляют в покое на 3–5 минут, затем производят отсчет на черном фоне.

Результаты.

1. Прозрачная жидкость или слегка опалесцентная жидкость = нормальная жидкость.
2. Слабо опалесцентная = +.
3. Опалесцентность с помутнением + +.
4. Осадок + + +.
5. Значительный осадок -- + +.

Реакция Нонне-Аппельта – положительная при некоторых поражениях центральной нервной системы (например сифилитических менингитах, при которых глобулины количественно увеличиваются от 1 до 4 г/ 100 мл).

Примечание. Спинномозговая жидкость не должна содержать крови.

Альбумин

Метод Сикар-Канталуб

Принцип. Осаждение альбумина трихлоруксусной кислотой при нагревании и измерение получаемого осадка градуированной трубкой.

Реактив. Раствор трихлоруксусной кислоты 33%.

Техника. Рахиальбуминометр Сикар-Канталуб (рис. 39) представляет собой стеклянную трубку, отградуированную в миллиметрах до 4. Первые два миллиметра разделены каждый на 5 подразделений. Трубка предусмотрена резиновой пробкой.

Рис. 39. Рахиальбуми- нометр Сикар-Канталуб.

Определение. Трубку Сикар наполняют 4 мл центрифугированной спинномозговой жидкостью до деления 4, нагревают до 80–90°, затем добавляют 12 капель трихлоруксусной кислоты 33% и оставляют на 5 минут. Затем трубку закупоривают, встряхивают и оставляют в покое в вертикальном положении до следующего дня, когда отсчитывают уровень образовавшегося осадка.

Результат отсчета выражают следующим образом:
до подразделения 1 = 22 мг/100 мл альбумина до подразделения 2 =» 40 мг/100 мл альбумина до подразделения 3 = 56 мг/100 мл альбумина до подразделения 4 = 71 мг/100 мл альбумина до подразделения 5 = 85 мг/100 мл альбумина.

Примечание. Если осадок получается в слишком большом количестве и не может быть замерен, спинномозговую жидкость разбавляют изотоническим раствором NaCl до проведения определения и пропорционально вычитают число капель трихлоруксусной кислоты 33%, израсходованной для определения, затем умножают полученный результат на степень.

Метод Хеллера

Принцип. Осаждение альбумина азотно-азотистой кислотой.

Реактив. Азотно-азотистая кислота. Смешивают 200 мл чистой азотной кислоты со 100 мл дистиллированной воды, добавляют 0,Об нитрита натрия и хорошо встряхивают.

Техника.

а) Качественная проба. В гемолизную пробирку берут 1 мл спинномозговой жидкости. Пипеткой Пастера отсасывают азота азотистую кислоту, затем кончик пипетки осторожно доводят до дна гемолитической пробирки и оставляют стечь примерно 1 мл реактива таки» образом, чтобы обе жидкости не смешивались.
Если образец содержит увеличенное количество альбумина, на границе раздела обеих жидкостей тотчас же или спустя 2–3 минуты образуется белое кольцо коагулированного альбумина. Кольцо тем толще и тем ярче выражено, чем больше количество альбумина. Исследование производится на черном фоне.

Экспериментально установлено, что если белое кольцо альбумина образуется через 3 минуты, образец содержит 3,3 мг альбумина на 100 мл.

б) Количественное определение (метод разбавлений). Если проверено содержание альбумина в жидкости, то берут 0,1 мл жидкости, добавляют 0,9 мл дистиллированной воды и слегка встряхивают, причем получается разбавление 1/10. С этим разбавленным образцом повторяют реакцию азотно-азотистой кислотой, отмечая момент добавления реактива. Если кольцо альбумина получается точно через 3 минуты, образец содержит 3,3 X 10 = 33 мг/100 мл альбумина. Если кольцо появилось до истечения 3 минуты, то делают еще большее разбавление: 1/15, 1/20, 1/25... 1/100, в зависимости от того, появилось ли кольцо раньше или позже и было ли оно более или менее ярко выраженным.

Реакцию азотно-азотистой кислотой повторяют снова и затем продолжают до тех пор, пока при последнем разбавлении характерное кольцо уже не появляется по истечении 3 минут.

При некотором навыке качественная реакция дает довольно легко указания относительно разбавлений, которые необходимо приготовить для того, чтобы не терять слишком много времени на поиски.

Пример. Мы приготовили разбавление 1:10, 1/15 и 1/20 и добавили азотно-азотистую кислоту. По истечении 3 минут производиться отсчет и наблюдают, что весьма тонкое белое кольцо появилось в пробирке разбавлениями 1/10 и 1/15 и не появилось в пробирке с разбавлением 1/20.

Следовательно образец содержит 3,3x15 – 49 мг альбумина/100.

Метод Местрезат

Принцип. Осаждение альбумина трихлоруксусной кислотой и его нефелометрическое определение сопоставлением с рядом стандартных образцов альбумина.

Реактивы.

1. Трихлоруксусная кислота 30%.

2. Стандартные образцы альбумина. Взбивают 3 яичных белка с равным объемом изотонического раствора NaCl, затем разбавляют 5-ью объемами изотонического раствора, хорошо смешивают и фильтруют, собирая первые 50 мл фильтрата. Берут 9,1 мл фильтрата и разбавляют изотоническим раствором до 200 мл, получая таким образом основной раствор, содержащий 1 г°/00 альбумина. Из этого раствора приготовляют серию эталонов содержащих: 0; 10; 20; 30; 40; 50; 60; 70 мг альбумина/100 мл.

В серию, состоящую из 7 гемолитических пробирок с наиболее одинаковым диаметром, берут по 2 мл стандартного раствора, полученного посредством разбавления основного раствора, в каждую из них прибавляют по 0,2 мл трихлоруксусной кислоты 30% и затем пробирки запаивают на пламени, избегая нагревания стандартного раствора. Оставляют в покое на 3 дня, после чего флокуляция является полной и равномерной. Эта серия стандартных растворов остается устойчивой в течение целого ряда лет.

Техника. В гемолитическую пробирку берут 2 мл жидкости, нагревают до 80–90°, добавляют 4 капли трихлоруксусной кислоты 30% и слегка встряхивают. Затем оставляют для охлаждения, после чего непрозрачность образца сопоставляется с непрозрачностью стандартных растворов. Операция производится вблизи окна, повернувшись спиной к свету, причем сравниваемые пробирки держат перед текстом, напечатанным на белой бумаге.

Примечание. Если непрозрачность образца превышает пределы серии стандартных растворов, жидкость разбавляют дистиллированной водой 1/1, 1/2 или 1/3 раза, а при расчете получаемое значение умножают на кратность соответствующего разбавления 2, 3 или 4.

Физиопатологические изменения. Нормальная спинномозговая жидкость содержит 15–20 мг альбумина/100 мл.

Гиперальбуминорахии встречаются при ряде болезней центральной нервной системы, как например: острые и хронические менингиты, в случае внемедулярных опухолей, а также при генерализованных инфекциях и весьма тяжелых интоксикациях. И наконец, следует отметить, что альбумин значительно увеличивается, достигая 800–4000 мг/100 мл при спинномозговом застое.

Гипоальбуминорахии наблюдаются при конгестивных состояниях нервной системы.

Глюкоза

Точное определение гликорахии производят микрометодом Хагедорн-Иенсена, используя для анализа 0,1 мл центрифугированной жидкости.

Примечание. Более быструю оценку гликорахии можно произвести также определением восстановительной способности глюкозы по отношению к раствору Фелинга.

а) Исследование гипогликорахии. К 2 мл центрифугированной жидкости прибавляют 0,2 мл раствора Фелинга и погружают в кипящую водяную баню. В этих условиях разбавления реакция становится особенно чувствительной. Жидкость, содержащая между 20 и 30 мг глюкозы/100 мл дает незначительное восстановление или же совсем никакого восстановления, вследствие чего надосадочная жидкость, находящаяся над осадком остается окрашенной в синий цвет, в то время как нормальная жидкость окрашивает смесь в оранжевый цвет.

б) Исследование гипергликорахии. Обращая вышеприведенные пропорции, сенсибилизирующие реакцию, гемолитическую пробирку, в которую взяли 0,6 мл центрифугированной жидкости, 2 мл дистиллированной воды и 2 мл раствора Фелинга, погружают на 1 минуту, в кипящую водяную баню. Окраска раствора остается синей, если жидкость соответствует норме или содержит небольшое количество глюкозы. Оранжевая окраска Си20, наблюдающаяся в результате осаждения, появляется только в случае, когда жидкость содержит более 70 мг глюкозы/100 мл.

Физиопатологические изменения. В нормальных условиях гликорахия колеблется в пределах от 5 до 70 мг на 100 мл. Следовательно, ее значение находится между 1/2 и 2/3 гликемии. Это соотношение остается постоянным, причем изменения гликорахии происходят в том же направлении, как и гликемии.

Повышение значения лишь только для гликорахии наблюдается при некоторых мозговых заболеваниях: опухоли, энцефалиты и др. Гликорахия значительно снижается при туберкулезном менингите, причем ее значения соответствуют течению болезни.

Хлориды

Метод был описан при определении хлоридов в крови и дает возможность произвести весьма точное определение хлоридов в жидкости.

Техника. В колбу Эрленмейера на 50 мл берут 1 мл центрифугированной жидкости, добавляют 10 мл азотнокислого серебра 0,02 н, 2,5 мл концентрированной азотной кислоты и 2 мл 5% железных квасцов. Затем титруют роданидом калия 0,02 н., добавляемым из 5 мл микробюретки до получения красно-оранжевой окраски, которая должна оставаться устойчивой в течение 30 секунд.

Видоизмененный метод Мора

Принцип. Прямое осаждение хлоридов азотнокислым серебром.

Реактивы.

1. Хромат калия 10%.
2. Раствор азотнокислого серебра. Растворяют 5,84 г азотнокислого серебра в 1000 мл дистиллированной воды. 10 мл из этого раствора должны титрироваться точно 2 мл раствора хлористого натрия 1 % (индикатор хромата калия 10%), который не подвергается порче и может быть приготовлен с высокой точностью. В случае необходимости, раствор азотнокислого серебра корректируется до соответствия этому условию.

Техника. К 2 мл центрифугированной жидкости добавляют 10 мл  дистиллированой воды и 3 капли хромата калия 10% (1), затем титруют раствором азотнокислого серебра (2) до начала перехода окраски в бурый оттенок.

Расчет. Пошедшее на титрование количество миллилитров азотнокислого серебра непосредственно указывает содержание хлоридов в жидкости (г/1000 мл).

Примечание. Метод отличается быстротой, однако он менее точен.

Физиопатологические изменения. В нормальной спинномозговой жидкости хлориды изменяются в пределах от 7,20 до 7,50 г/1000 мл. Повышенные значения, сопровождающие повышенные значения в крови наблюдаются при нефритах, абсцессах и мозговых опухолях.

Хлориды снижаются при нетуберкулезном остром менингите, при туберкулезном менингите, при котором их снижение менее 5 г/1000 мл указывает на угрожающий прогноз, а также при спинномозговом застое.

Реакция с перманганатом калия

Тест восстановления перманганата указывает на поведение спинномозговой жидкости в течение воспалительных процессов.

Техника. К 1 мл спинномозговой жидкости добавляют 0,1 мл раствора перманганата калия 1,5%. Встряхивают и отмечают время, необходимое для перехода исходной фиолетовой окраски в янтарно-желтый цвет.

Обсуждение теста. Физиологическая продолжительность восстановления перманганата составляет 15–20 минут. Это время значительно сокращается, даже доходя до нуля в случае воспалительных заболеваний или реакции нервной системы: острые менингиты (токсикозы) и др.

Мы применили эту реакцию для исследования спинномозговой жидкости при туберкулезном менингите в более 100 случаев. Результаты соответствуют химизму жидкости и клиническому развитию болезни.
Повышение продолжительности восстановления перманганата является благоприятным признаком для прогноза, а нормализация реакции соответствует клиническому выздоровлению больных; кроме того, установлено, что проведение реакции оказывает существенную пользу и для отдаленного контроля излечения у больных, выписавшихся из больницы вылеченными от 6 до 12 месяцев тому назад.

Мочевина

В спинномозговой жидкости мочевину определяют по методу Коварского, используя вместо трихлоруксусного фильтрата 2,5 мл жидкости.

Исследование триптофана

Метод Гопкинс-Колле

Принцип. Триптофан дает фиолетовую окраску с оксалатом магния в кислой среде.

Реактивы.

1. Оксалат магния: к 10 г порошкообразного магния добавляют до 250 мл насыщенного раствора щавелевой кислоты. После того как выделение газа прекращается, фильтруют в мерную колбу на 1 мл, значение pH доводят до кислотности (индикатор-лакмус) ледяной уксусной кислотой, затем дополняют дистиллированной водой до метки.
2. Концентрированная серная кислота.

Техника. В пробирку берут 5 мл оксалата магния (1) и добавляют 2 мл жидкости. Слегка встряхивают, затем осторожно добавляют 1 мл серной кислоты (2), которая стекает по стенкам пробирки таким образом, чтобы обе жидкости не смешивались. В присутствии триптофана на границе раздела обеих жидкостей появляется кольцо фиолетового цвета. Реакция является отрицательной, если кольцо не образуется или появляется бурый цвет.

Обсуждение результата. Реакцию триптофана можно использовать для дифференциального диагноза между туберкулезным менингитом и менингитами иной этиологии, причем она является положительной только в случае теберкулезного менингита.

Исследование ацетона

Принцип. Ацетон в присутствии едкого калия с салициловым альдегидом дает красно-оранжевую окраску (реакция Фроммер-Эмиливич).

Реактивы:

1. Салициловый альдегид 10% в спирте 95°.
2. Едкий калий в таблетках.

Техника. К 2 мл жидкости, влитым в пробирку добавляют 2 капли салицилового альдегида 10%(1) и 1 таблетку едкого калия (2), затем слегка нагревают. В присутствии ацетона вокруг таблетки едкого калия появляется красно-оранжевый цвет.

Диагностическое значение. Реакция отличается исключительно высокой чувствительностью и может быть использована для диагноза диабетической комы или при исследовании в случае ацидоза.

Проницаемость к нитратам

Тест применяют для установления нарушения менингеальной проницаемости посредством определения нитратов, перешедших в спинномозговую жидкость после приема за 3 часа до пункции 1 г нитрата натрия/30 килограмм живого веса, растворенного в стакане воды.

Принцип: в присутствии серной кислоты, нитраты дают с дифениламином синюю окраску.

Реактивы:

1. Чистая концентрированная серная кислота.
2. Дифениламин 1 % в серной кислоте 70% (об).
3. Нитрат натрия 1 г°/00 стандартного раствора. Раствор содержит 1 мг нитрата /мл. Из этого основного раствора приготовляют серию эталонов, содержащих 1; 2; 3; 4; 5 и 6 мг нитрата/100 мл.

Техника. В пробирку берут 3 мл серной кислоты (1) и добавляют 4 капли дифениламина 1% (2), приливаемого на поверхность кислоты. Поверхностный слой помешивают стеклянной палочкой, затем добавляют 3 капли спинномозговой жидкости, после чего поверхностный слой снова размешивают стеклянной палочкой для того, чтобы способствовать появлению окраски на границе раздела между обеими жидкостями. Одновременно с этими операциями берут другие 2 пробирки возможно более сходного диаметра, в которые вливают стандартные растворы различной концентрации (например: 2 мг% и 3 мг%), которые затем обрабатывают таким же образом.

Спустя пять минут, когда синие кольца развились в достаточной мере и далее не увеличиваются, жидкость встряхивают для получения равномерной окраски, затем окраска образца сопоставляется с окраской стандартных растворов на белом, хорошо освещенном фоне, стене или белой бумаге.

Диагностическое значение пробы устанавливается учитывая, что нормальная жидкость содержит 1 мг нитратов/100 мл.

Реакция с коллоидным бензое

Реактивы:

1. Изотонический раствор NaCl.
2. Бензойная смола 10%, в спирту. Хорошо растирают в ступке 10 г суматрового бензое, затем переводят в бутылку, добавляя 100 мл абсолютного спирта, энергично встряхивают и оставляют на 3 дня в термостате при 37°. Центрифугируют и отделяют надосадочную жидкость, которую можно сохранять в течение продолжительного времени при комнатной температуре.

Для приготовления коллоидной взвеси перед употреблением смешивают, слегка встряхивая 0,3 мл надосадочной жидкости с 20 мл бидистиллированной воды, нагретой до 35° в водяной бане.

Техника. На штатив помещают 16 гемолитических пробирок, пронумерированных от 1 до 16. В первую пробирку берут 0,25 мл изотонического pacтвopa NaCl (1), во вторую 0,50 мл, в третью 1,50 мл, а в остальные пробирки – по 1 мл изотонического раствора. Затем добавляют 0 75 мл жидкости в первую пробирку, по 0,50 мл в следующие две пробирки берут 1 мл разбавленной жидкости из третьей пробирки и переводят в четвертую, продолжая таким образом до предпоследней пробирки, из которой выбрасывают 1 мл смеси. Следовательно, первые 15 пробирок содержат по 1 мл жидкости, разбавленной в геометрической прогрессии от 3/4, 1/2, 1/4 д0 1/16 384; последняя пробирка служит для контроля.

Рис. 40. Типы реакции с коллоидальным бензое. А – тип положительной реакции (стертый спинномозговой сифилис). В – тип положительной реакции (генерализованный паралич)

Затем во все пробирки добавляют по 1 мл водной суспензии коллоидного бензое (2), слегка встряхивают и оставляют на сутки в покое при комнатной температуре.

Отсчеты реакции, запись и обсуждение результатов. В пробирках, в которых реакция оказывается отрицательной, взвесь сохраняет свой исходный равномерный опалесцентный вид, также как и контрольный образец, в то время как в пробирках с положительной реакцией флокуляция имеет место полностью, жидкость совершенно прозрачна, а смола осаждается на дне пробирки.

Для записи результатов пользуются системой двух координатных осей записывая на абсциссе порядковые номера взятых 16 пробирок, а на ординате — степень интенсивности реакций. Отрицательная реакция отмечается через ноль, слабоположительная (начало приобретения жидкостью прозрачного вида) через 1, а наиболее положительная — через 2 (рис. 40 АВ или 41 АВ).

Рис. 41. Типы реакции с коллоидальным бензое. А – тип положительной реакции (туберкулезный менингит), В – тип отрицательной реакции.

Нормальные жидкости дают в основном ограниченную флокуляцию в пробирках 6 и 9.

Патологические жидкости, полученные у больных страдющих неспецифическими заболеваниями (менингитами и др.) характеризуются обширной зоной флокуляции, простирающейся в большей или меньшей мере вправо и никогда влево.

В случае жидкостей, происходящих от больных сифилисом, зона флокуляции расположена в левой стороне: пробирка 1–9, иной раз до пробирки 13. Реакция является положительной при общем параличе, спинномозговом сифилисе.