Цитохимические методы при микроскопии
В основе цитохимических исследований лежит окрашивание специально подобранными красителями, избирательно реагирующими с отдельными химическими компонентами структур клетки. Так, белки выявляют путем обработки препарата реактивами, специфически реагирующими с аминогруппами, сульфгидрильными или дисульфидными группами, либо с отдельными аминокислотами. Для выявления ДНК можно использовать реакцию Фельгена (слабый кислотный гидролиз, отщепление пуриновых оснований, реакция альдегидных групп с фуксиносернистой кислотой с развитием красно-фиолетовой окраски). РНК окрашивают основными красителями (азур II, тионин). Окисление полисахаридов йодной кислотой вызывает образование альдегидных групп, реагирующих с фуксиносернистой кислотой (реактив Шиффа или PAS-реакция). Кислые мукополисахариды выявляют с помощью метахромазии, т.е. окрашивания некоторыми основными красителями (например, толуидиновым синим) в цвет, отличный от цвета самого красителя (в данном примере – красно-фиолетовый). Липиды окрашиваются жирорастворимыми красителями (судан красный и черный), отдельные их классы – с помощью специфических красителей.
Неорганические вещества (железо, калий, фосфаты, кальций др.) можно окрасить известными специфическими для этих ионов реагентами. Ферменты выявляют путем обработки препаратов субстратами этих ферментов с образованием продуктов реакции, имеющих окраску или поддающихся окрашиванию.
Дальнейшим развитием цито- и гистохимического направления явилось использование меченных различными метками антител, направленных против определенных клеточных структур и их отдельных компонентов (иммуноцито- и гистохимия). Для этого направления используют различные варианты методов специфического связывания и разнообразные хромогены. Иммуногистохимические методы позволяют локализовать и идентифицировать клеточные и тканевые антигены, основываясь на их связывании с антителами. Использование антител лежит в основе изучения различных образований: структурных компонентов клетки; клеточных продуктов (гормонов, ферментов, иммуноглобулинов); рецепторов клеточной поверхности. Для визуализации места связывания антигена с антителом применяют разные метки: флюоресцентные красители; ферментные метки; металлы; металлопротеины; радиоизотопы.
Первоначально визуализацию тканевых антигенов иммуноферментными способами окраски проводили прямым методом с использованием ферментов, непосредственно конъюгированных с антителами известной антигенной специфичности. Этот метод позволяет применять световой микроскоп, но обладает низкой чувствительностью. Чувствительность иммуногистохимического окрашивания была значительно повышена с использованием непрямого метода, в котором меченые ферментом антитела связываются с первыми антителами, соединенными с антигеном. Впоследствии появились и трехэтапные методы, такие как пероксидазно-антипероксидазный метод, метод с использованием авидин-биотинового комплекса. Новое поколение ферментопосредованных методов окрашивания препаратов позволяет проводить эти исследования с высокой специфичностью и чувствительностью при наличии только светового микроскопа. Это делает доступными современные методы исследования даже для лабораторий, не оснащенных специальным оборудованием.
Несмотря на бурное развитие иммунологии и цитогенетики, простые цитохимические методы, не требующие сложной и дорогой аппаратуры, основанные на использовании достаточно простого светового микроскопа, хорошо воспроизводимые, информативные, востребованы во многих лабораториях. Они не утратили своего значения в диагностике различных форм гемобластозов. Особенно оно велико в подтверждении острых миелоидных лейкозов. В настоящее время некоторые производители выпускают готовые наборы реактивов, позволяющие получать хорошо воспроизводимые и правильные результаты.
Цитохимические методы позволяют изучить содержание различных веществ и активность ферментов в клетках крови, костного мозга, лимфатических узлов и других тканей. Применяя их в гематологии в комплексе с морфологической оценкой клеточных элементов, можно выявить направленность дифференцировки кроветворных клеток. Основой идентификации этих клеток служат особенности их метаболизма. В большинстве случаев цитохимическую реакцию оценивают качественно (слабая, умеренная, интенсивная) с указанием процента положительно реагирующих клеток. Существует и полуколичественный метод оценки результатов в условных единицах или с вычислением среднего цитохимического коэффициента (СЦК).
Методы специального окрашивания для выявления активности миелопероксидазы по окислению хромогенов о-дианизидина и бензидина, реакции на липиды (окрашивание с суданом черным Б), РAS-реакция на присутствие в клетках гликозаминогликанов (мукополисахаридов), реакции на неспецифическую эстеразу с использованием а-нафтилацетата и других субстратов с постановкой реакции ингибирования активности эстеразы фторидом натрия представляют собой стандартную панель цитохимических методов, которой в большинстве случаев в онкогематологии бывает достаточно для выявления линейной принадлежности опухолевых клеток, и, следовательно, для выявления варианта острого лейкоза и бластных кризов при хроническом миелолейкозе.
В некоторых случаях, например при использовании цитохимической реакции на тартратрезистентную фракцию кислой фосфатазы при волосатоклеточном лейкозе, можно определить принадлежность клеток к опухолевому клону. Реакции на щелочную фосфатазу с применением а-нафтилфосфата или фосфорных эфиров более сложных нафтолов применяют для дифференцирования хронического миелолейкоза от других миелопролиферативных заболеваний и реактивных состояний.
Повышение активности щелочной фосфатазы наблюдается при истинной полицитемии и миелофиброзе, хроническом метакариоцитарном лейкозе, резкое снижение активности наблюдается при хроническом миелолейкозе. Реакция с берлинской лазурью на содержание в цитоплазме эритробластов и эритроцитов (т. е. сидеробластов и сидероцитов) негемоглобинового железа позволяет выявить истощение запасов железа при железодефицитной анемии или избыточное накопление железа при различных вариантах гемохроматоза, талассемии.
Для определения количества веществ в клетках используют цитоспектрофотометрию. Она основана на измерении поглощения ими лучей света определенной длины волны. Результаты измерения автоматически пересчитываются в количество вещества, поглощающего монохроматический свет определенной длины волны.
