Диссоциация активности дегидрогеназ от активности цитохромной системы

Как указано во многих авторитетных источниках, ряд конечных процессов окислений-восстановлений, в случае если они имеют место в условиях аэробиоза, интересуют в конечном итоге цитрохромную систему, обеспечивающую «активирование» молекулярного кислорода с целью его присоединения к водороду переведенному дегидрогеназами с субстрата.

Подобный процесс имеет место в случае энзиматического окисления сукцината, причем образуется фумарат. Процесс происходит в 4 этапа:

• восстановление янтарной кислоты в фумаровую кислоту специфичной дегидрогеназой; Эта реакция ингибируется в присутствии яблочной кислоты, щавелевоуксусной кислоты, кобальта, пирофосфата, селенитов, арсенита и др.
• переход электронов к цитохромной системе;
• переокисление цитохрома с цитохромоксидазой;
• активирование кислорода цитохромоксидазой с целью фиксации водородного иона.

Циановый ион блокирует реакции (в) и (г). Цитохромную систему и цитохромоксидазу (реакции б, в и г) можно заменить метиленовой синью в качестве водородного акцептора, причем присутствие цианида не влияет на активность. Благодаря этому можно измерить активность дегидрогеназы независимо от активности цитохромной системы.

С другой стороны, активность катализаторов реакции (в) и (г) можно также измерить независимо от активности дегидрогеназы, используя в качестве субстрата п-фенилендиамин вместо янтарной кислоты. Янтарный дегидрогеназ не оказывает никакого влияния на это вещество, которое, однако, преобразуется цитохромом «с» в бензохинон, причем эта реакция происходит с фиксацией кислорода.

Пользуясь этими различиями в отношении поведения к субстратам и упомянутым ингибиторам, можно отделить дегидрогеназную активность от активности цитохромной системы. Метод использует аппарат Варбурга.

В качестве реактивов необходимы растворы 0,1м: сукцината, малоната, цианистого калия, парафинилендиамина и фосфатный буферный раствор с pH 7. Кроме того, приготовляют также раствор метиленовой сини 0,05%.

Для получения энзимовой взвеси берется около 100 г сердечной мышцы, удаляют жир и соединительную ткань, размельчают как можно тоньше и промывают несколько раз в 10 объемах водопроводной воды (фильтруют через марлю) до тех пор пока промывочная вода не перестанет окрашиваться. К промытой ткани добавляют 1 объем фосфатного буферного раствора 0,1 м. с pH 7,0 и 1 объем мелко измельченного льда. Смесь подвергается механическому растиранию (Waring blendor), или с кварцевым песком. После тщательного растирания препарат центрифугируют или в случае необходимости фильтруют через фильтр Зейца.

Для проведения определения применяют три набора по 4 реакционных сосуда Варбурга, в которые реактивы и энзиматический препарат берут в количествах приведенных в таблице XLVII (в нижнюю чашу реакционных сосудов вводят 0,25 мл КОН 10%).

Реакционные системы в первом наборе позволяют установить ингибицию окисления сукцината за счет цианида, а также почти полное прекращение этой ингибиции в присутствии метиленовой сини, доказывая таким образом, что блокировка происходит на уровне цитохромной системы.

Реакции протекающие во втором наборе доказывают ингибицию реакции дегидрирования сукцината в присутствии малоната. Вместе с тем, тот факт, что ингибицию можно избежать в присутствии избытка сукцината, указывает на его преобладающую сущность.

Третий набор показывая, что каталитическое окисление п-фенилен-диамина ингибируется цианидом, но не малонатом, доказывает, что оно катализируется цитрохромной системой.

Вместе с тем, на основании ряда реакционных систем, приготовленных аналогичным образом, можно установить, что в отличие от малоната, избыток сукцината является неэффективным по отношению к ингибиции системы вызываемой цианидом. Присутствие метиленовой сини не может прекратить ингибицию окисления п-фенилендиамина, вызываемую цианидом. Предварительное нагревание тканевого экстракта при 100°С уничтожает его каталитическую активность.