Электрофорез биологичеcких веществ
Метод электрофореза основан на перемещении заряженной частицы в растворе под влиянием электрического поля. Для осуществления электрофореза необходимы: среда (обычно буферный раствор с определенным значением pH) или носитель (при зональном электрофорезе), смесь веществ, подлежащих разделению, электрическое поле. Наиболее часто в качестве носителей используют фильтровальную бумагу, мембраны (например, ацетат целлюлозы). В последние десятилетия начали применять как носители различные гели, например агар, крахмал и особенно полиакриламидный. Последний является более совершенным носителем по сравнению с вышеупомянутыми.
Полиакриламидный гель прозрачен, бесцветен, термостабилен, противостоит кипячению и замораживанию, обладает большой прочностью и упругостью. В широко используемых в лабораториях органических растворителях и буферах гель не растворяется.
Для приготовления полиакриламидных гелей с небольшим исключением можно использовать многие буферные системы с интервалом pH 1-11. Преимуществом полиакриламидных гелей является отсутствие (или очень незначительный) эндоосмоса, адсорбаций и регулируемая степень пористости. Большое значение имеет то, что гели можно формировать в калиброванных трубках или каналах.
Реакция полимеризации происходит в присутствии свободнорадикального катализатора — смеси 0,1-0,3% (весовые проценты) персульфата аммония. Пористость геля зависит от соотношения акриламида и сшивающего агента.
Полиакриламидные гели можно получать в пределах 3-30% (весовые проценты) содержания акриламида. Это соответствует размерам пор 0,2-0,5 нм.
В биохимических и клинико-диагностических лабораторных исследованиях используют различные методы электрофореза: высоковольтный, непрерывный, иммуноэлектрофорез, изотахофорез, изоэлектрическое фокусирование, диск-электрофорез. Последний находит все более широкое применение, вытесняя другие. В связи с этим приводим краткие сведения о нем.
Термин «диск-электрофорез» обозначает прерывистость. Он отражает сущность метода, основанного на использовании неоднородной («прерывистой») среды (гелий) и буферных растворов различного состава и с разными значениями pH. В качестве носителя применяется полиакриламидный гель. При диск-электрофорезе используют парыбуферных растворов различного состава и с разными значениями pH.
Структура носителя состоит из отдельных слоев геля с различными размерами пор каждого. Для электрофореза подбирают буферные растворы такого состава, чтобы разделяемые вещества приняли отрицательный заряд.
Диск-электрофорез по сравнению с обычным методом зонального электрофореза имеет много преимуществ: малые количества требуемого материала, отсутствие предварительного концентрирования разбавленных растворов исследуемых веществ, быстрота разделения и высокая разрешающая способность, высокая чувствительность, которую можно сравнить лишь с чувствительностью иммуноэлектрофореза. С помощью диск-электрофореза можно исследовать различные классы соединений: белки, протеиды и нуклеиновые кислоты, антигены, ферменты и многие другие. Кроме того, метод осуществляется с помощью простой аппаратуры: стеклянных трубочек или пластин с каналами и сосудов для буферных растворов.
При вертикальном диск-электрофорезе с дисковыми буферными системами применяют два, иногда три наслаиваемых друг на друга полиакриламидных гелей: проба — гель («sample» — гель), концентрирующий гель («spacer» — гель), фильтрующий или сепарирующий гель («running» - гель).
Нас рис. 82 показаны принципиальная схема полиакриламидной гелевой колонки и основные конструктивные элементы приборов для электрофореза.
Как видно из рис. 82, в нижнем сосуде находится анод, а в верхнем — катод. В прибор для электрофореза входит также источник питания. Исследуемые образцы вносят на поверхность столбиков геля при заполненном буферным раствором нижнем сосуде. Затем буферным раствором заполняют и верхний сосуд, забывают крышкой и при включенном токе проводят электрофорез.
На рис. 83 показана динамика диск-электрофореза в полиакриламидном геле с обозначением значений pH буферов и гелей.
Проба — гель (крупнопористый стартовый) предупреждает смешивание растворов пробы с электродным буфером. Большинство исследователей в настоящее время отказываются от него.
Концентрирующий гель является крупнопористым, в результате чего вещества образца свободно передвигаются и концентрируются при подходе к разделяющему гелю в виде чрезвычайно узкой полосы. Концентрированию образца благоприятствует также различное значение pH буферов в верхнем сосуде и концентрирующем геле. Разделяющий или рабочий гель действует по принципу молекулярного сита. В нем происходит разделение веществ образца.
Во многих отечественных лабораториях широко применяются приборы для диск-электрофореза в полиакриламидном геле и наборы реактивов завода химреактивов «Реанал» ВНР. Мы приводим описание одного из упомянутых приборов и некоторых его усовершенствований, сделанных нами. При изложении этого материала использован проспект указанного завода.
Приборы завода «Реанал» являются технически совершенными, высокопроизводительными, они просты в работе, безопасны в обращении. Наборы реактивов к этим приборам также удовлетворяют требованиям различных исследований с применением диск-электрофореза в полиакриламидном геле.
На рис. 84 изображен прибор для диск-электрофореза в полиакриламидном геле «Модель-69», а на рис. 85 — основные блоки этого прибора. На рис. 86 показано расположение деталей уплотняющей системы на стеклянной трубочке, а на рис. 87 — расположение стеклянных трубок и деталей уплотняющей системы после подсоединения к верхнему резервуару для буфера.
Рис. 84. Прибор для диск-электрофореза в полиакриламидном геле «Модель-69» для аналитических целей: 1 — резервуар для верхнего буфера; 2 - резервуар для нижнего буфера; 3 — ножки, с помощью которых соединяются указанные резервуары; 4 — винты с гайками для крепления ножек 3; 5 — цилиндрический электрод-держатель; 6 — электроды; 7 — стеклянные трубки; 8 — резьбовые отверстия в дне верхнего резервуара для закрепления в них трубок 7; 9 — резьбовая уплотняющая гайка; 10 — прокладочное кольцо с внутренней конусной поверхностью; 11 — резиновое кольцо-прокладка; 12 — крышка для закрытия верхнего резервуара; 13 — разливочный блок; 14— резьбовые углубления в разливочном блоке
Рис. 85. Основные блоки прибора «Модель-69» для полиакриламидного диск-электрофореза (пояснения под рис. 84)
В приборе типа «Модель-69» можно проводить электрофорез одновременно 12 образцов.
Усовершенствованный разливочный блок для заготовки гелевых трубок в приборах для диск-электрофореза завода химреактивов «Реанал» ВНР
В отверстиях 2 входящего в комплект прибора завода «Реанал» разливочного блока для заготовки гелевых трубок посередине делают сферические формирующие лунки 7 (рис. 88). Диаметр лунок равняется внутреннему диаметру гелевых трубок 3, входящих в комплект указанного прибора. Глубина лунок составляет 1,5-2,0 мм. После гелеобразования и освобождения гелевых трубок 3 из отверстий подставки в своих нижних концах они имеют сферическую выпуклую поверхность. На такой поверхности не скапливаются пузырьки воздуха во время погружения их в буферный раствор. Отпадает, таким образом, кропотливая, неудобная операция многократного обмакивания или встряхивания гелевых трубок вместе с резервуаром для буфера. Стандартизируется и намного повышается точность всего процесса электрофореза.
Рис. 88. Усовершенствованный разливочный блок для заготовки гелевых трубок (справа — часть блока с фиксированной в нем трубкой для геля)
Устройство и методика заготовки и фиксации гелевых трубок в приборах для электрофореза завода химреактивов «Реанал» ВНР
Для заготовки трубок с гелем в вышеописанном приборе для электрофореза в полиакриламидном геле (рис. 84) последние фиксируются в углублениях разливочного блока для полимеризации с помощью уплотнительной системы. После гелеобразования трубки с гелем укрепляют в концентрически расположенные отверстия, просверленные в дне верхнего буферного резервуара с помощью вышеуказанной уплотнительной системы. По окончании электрофореза гелевые трубки вынимают из верхнего буферного резервуара для удаления из них гелевых столбиков. Операция фиксирования трубок в дне верхнего буферного резервуара не очень удобна из-за специфического конструктивного расположения отверстий и отнимает много времени. Кроме того, при этом не исключена возможность протекания буфера из верхнего резервуара вследствие неплотного подгона зажимными кольцами резиновых колец-прокладок к гнёздам резервуара и трубкам. Для устранения указанных недостатков нами сконструировано устройство (рис. 89).
Устройство, .изготовляют из органического стекла или фторопласта. Оно напоминает круглую муфту. С одной стороны в нем делают тупое отверстие резьбой 2. Диаметр отверстия равняется наружному диаметру резьбовой уплотняющей гайки, которая входит в комплект прибора для электрофореза завода «Реанал». Резьба 2 в отверстии имеет та кой же размер, как и резьба на этой гайке. В донной части отверстия посередине выполняют сферическую лунку 3. Диаметр лунки равен внутреннему диаметру стеклянных трубок для формирования в них геля.
Благодаря наличию лунки 3 в отверстии трубки 9 с образовавшимся в них гелем имеют внизу выпуклую поверхность. На такой поверхности не скапливаются пузырьки воздуха при погружении трубок в раствор буфера для электрофореза.
Стеклянные трубки 9 фиксируются в углублениях в дне верхнего буферного резервуара 8 как описано в инструкции к приборам. Перед заполнением трубок гелем на нижний конец их надевают описанное выше приспособление 1, которое фиксируют с помощью резьбовой уплотняющей гайки прокладочного кольца 6 и резинового кольца-прокладки 4 входящих в комплект прибора. В фиксированных гелевых трубках согласно той или другой методики формируют разделяющий, концентрирующий гель и проба-гель. После их образования устройство 1 снимают. В нижний и верхний резервуары заливают буферные растворы и проводят электрофорез. По окончании электрофореза гелевые столбики удаляют из трубок обычным способом. При этом трубки остаются фиксрованными в верхнем буферном резервуаре. Моются трубки в этом положении обычным способом.
Предложенное устройство позволяет выпускать приборы с заблаговременно фиксированными стеклянными трубками в дне верхнего буферного резервуара в заводском исполнении.
Приборы для электрофореза в полиакриламидном геле с прямоугольными каналами для геля
При денситометрии или фотографировании цилиндрических гелевых столбиков после электрофореза отрицательное влияние оказывает сферическая аберрация. Фотографирование указанных столбиков в жидкостях лишь частично решает проблему. Продольное разрезание их отнимает время и также не приводит к получению результатов необходимой точности. В связи с указанными недостатками диск-электрофореза из-за применения цилиндрических гелевых столбиков в последнее время исследователи конструируют приборы, в которых можно получать гели в виде прямоугольных пластинок. Они лишены упомянутых выше недостатков. Кроме того, приборы с прямоугольными каналами для геля намного производительнее приборов, в которых применяются цилиндрические гели. К преимуществам прямоугольных столбиков геля относится и то, что при электрофорезе в них выделяется меньше тепла, а также имеется возможность проводить электрофорез различных проб в идентичных условиях.
Приборы для проведения электрофореза с применением в них прямоугольных столбиков изготовляют, в основном, из органического стекла, которое является в таких случаях незаменимым конструктивным материалом. Но с его поверхности трудно и кропотливо осуществлять наслоение дистиллированной воды и водных растворов на гель или другие растворы. Это связано с гидрофобностью органического стекла, в результате чего наслаиваемая жидкость собирается на. стенке канала в виде капли и падает, смешиваясь с жидкостью, на которую идет наслаивание. По вышеуказанной причине раствор исследуемого вещества часто проходит между стенкой канала и поверхностью геля, что делает разделение не качественным и не точным. Особенно при низких концентрациях геля. Гели рациональнее формировать в стеклянных сосудах, поскольку стекло является гидрофильным и к нему, хорошо оседает гель и соответственно сравнительно легко с его поверхности осуществлять операцию наслаивания водных растворов. Операция наслаивания является определяющей, от четкости ее выполнения зависит точность электрофоретического разделения.
На рис. 90 показан один из таких приборов, который разработали Б. П. Мищенко, В. В. Зайцев (1977). Но ему свойствен тот же недостаток, какой имеют приборы фирмы «Реанал» (ВНР), а именно: каждую гелевую трубку необходимо фиксировать в электродной камере. Кроме того, сложна процедура удаления гелевого столбика из трубки.
Рис. 90. Усовершенствованный прибор для электрофореза в полиакриламидном геле
Нами разработано устройство для диск-электрофореза в полиакриламидном геле с прямоугольными каналами для геля, а также устройство для наслаивания.
Устройство для диск-электрофореза в полиакриламидном геле
В пластине 2 (рис. 91) из органического стекла в верхней пятой части делают углубление 4 с одной стороны во всю ширину, не доходя до краев на 5-7 мм. По бокам пластины ниже углубления 4 на расстоянии 3-4 мм от краев делают симметрично по три отверстия для барашковых винтов 1. В пластине 3 аналогично делают углубление 4 и отверстия для барашковых винтов 1.
Топография и размеры углублений и отверстий для винтов строго совпадают в обеих пластинах при их накладывании одна на другую углублениями и каналами для геля во внутрь. Вследствие этого образуются треугольные ходы 16 между каналами 11, соединяющими их между собой. В нижней части каналов на их поверхности сразу у края делают углубления-штампы обратных цифр (номеров каналов) длиной 3-4 мм. В верхней части каналов делают углубления-пазухи 14 для стеклянных пластин 5 толщиной приблизительно 1 мм. Эти углубления-пазухи на 1 мм больше ширины каналов с каждой стороны и ниже поверхности канала на толщину стеклянной пластины 5, как показано на рис. 91. В углубления-пазухи вставляют соответствующих размеров стеклянные пластины 5, Последние должны входить плотно, чтобы не выпадали при опрокидывании пластины с каналами. В верхней части пластины 3 в области углубления 4, отступив от края на 4-5 мм, как можно ближе к середине, в отверстия герметично вставляют электрод 7, а электрод 8 — в камеру 13.
Устройство в действии
Внутренние поверхности пластины 3, т. е. промежутки 6 и боковые выступы за пределами каналов, кроме каналов 11, смазывают силиконовой смазкой. Пластины 2 и 3 накладывают одна на другую их внутренними поверхностями с углублениями 4 и каналами 11. Пластины в таком виде скрепляют барашковыми винтами. За счет углублений 4 в обоих пластинах образуется резервуар для буферного раствора.
На поверхность полиакриламида в каналах наслаивают равное количество дистиллированной воды в каждый канал посредством стеклянных пласт 5. В связи с тем что стекло является гидрофильным веществом, из поверхности пластин вода и буферный раствор равномерно стекают и наслаиваются на поверхность геля не смешиваясь с ним. После образования геля в каналах свободную верхнюю часть каналов над гелем заполняют исследуемым образцом и буферным раствором путем наслаивания аналогично наслаиванию дистиллированной воды. При внесении образцов исследуемого материала записывают наименование образца и номер канала, в который он вносится.
Буферным раствором заполняют верхний резервуар, образованный углублениями 4 в пластинах 2 и 3, поверх электрода 7. Для проведения электрофореза этот блок с каналами и гелем в них помещают в камеру 13 на две подставки из органического стекла 9. При этом электрод 8 находится ниже блока на некотором расстоянии в соответствии с методикой. В камеру 13 наливают буферный раствор. При этом блок должен быть погружен в раствор нижним концом на 2-3 см. Подводя к электродам постоянный ток проводят электрофорез согласно методике. После проведения электрофореза блок вынимают, пластины 2 и 3 разъединяют, гелевые столбики вынимают из каналов с помощью дистиллированной воды и маленькой пластмассовой лопаточки. При этом на каждом гелевом столбике в нижней части имеется номер канала, в котором он находился. Вынутые из каналов гелевые столбики помещают все в один сосуд и в нем производят дальнейшую обработку согласно методике (промывают, фиксируют и др.) После обработки их хранят в том же сосуде.
При снятии с гелевых столбиков окончательной информации результатов электрофореза учитывают номер, который имеется внизу на каждом гелевом столбике: соответствующий номеру канала, где формировался гелевый столбик. Этот номер на поверхности гелевого столбика образуется вследствие того, что при формировании его раствор полиакриламида заполнил углубления-штампы обратных цифр-номеров каналов.
Операцию наслаивания дистиллированной воды и водных растворов на поверхность геля при отсутствии пластин 5 в каналах можно осуществлять с помощью полосок 2 из целлофановой пленки, материал которой является сравнительно гидрофильным веществом. Кроме целлофановых полосок можно применять хлопчатобумажное, льняное волокно или ткань. Техника наслаивания показана на рис. 92.
Рис. 92. Техника наслоения дистиллированной воды на поверхность геля из полиакриламида: 1 — канал для геля в приборе для диск-электрофореза; 2 — целлофановая полбска; 3 — поверхность раствора полиакриламида
Заблаговременно нарезают множество указанных полосок длиной 20-30 мм. Ширина их на 1-1,5 мм уже ширины каналов 1. В канал 1 вносят раствор полиакриламида 3. Целлофановую полоску погружают в раствор полиакриламида на 2-3 мм. Верхний конец полоски отгибают в сторону наружу. Затем с помощью медицинского шприца выпускают маленькими каплями дистиллированную воду на полоску 2. С нее вода стекает и наслаивается ровно на поверхность раствора полиакриламида. После этого полоску осторожно вынимают. Под наслоенной водой идет гелеобразование. В указанных условиях получаются гладкие и ровные поверхности гелей.
Устройство для диск-электрофореза в полиакриламидном геле с каналами для геля в стекле
Нами разработано устройство для диск-электрофореза в полиакриламидном геле, в котором прямоугольные каналы выполнены в стекле (рис. 93.) Устройство лишено недостатков, которые свойственны приборам с цилиндрическими гелями и прямоугольными каналами, выполненными из плексигласа.
Рис. 93. Устройство для диск-электрофореза в полиакриламидном геле с каналами для геля в стекле: а: общий вид устройства; б - блок из стеклянных пластин с каналами для геля, пластин из плексигласа, служащих каркасом для первых; 1 — верхний резервуар; 2 — фиксированные винты в дне верхнего резервуара; 3 — вырез в дне верхнего резервуара; 4 - электроды; 5 — прикрепленные к верхнему резервуару пластины; 6 — блок с каналами для геля; 7 — нижний резервуар; 8, 11 — стеклянные пластины для прикрытия каналов; 9 — плексигласовые пластины-площадки прикрепления блока ко дну верхнего резервуара; 10— отверстия в площадках у для фиксированных винтов в дне верхнего резервуара; 12 — пластина с каналами для геля; 13 —промежутки между каналами для геля; 14 - каналы для геля в стеклянной пластине; 15 — пазы в плексигласовых пластинах 16 и 17; 16, 17 — плексигласовые пластины; 18— барашковый винт
Резервуар 1, как и резервуар 7, изготовляют прямоугольной формы склеиванием из листового плексигласа. Емкость каждого резервуара составляет 1,2-1,5 л. В дне резервуара 1 посередине делают продольный вырез 3. Размеры выреза соответствуют размерам прямоугольника, оконтурирующего каналы для геля в блоке 6, непосредственно из стеклянных пластин 8, 12, 11. Контур прямоугольника проходит на 1-2 мм от краев каналов. На расстоянии 2-3 см от выреза по двум широким сторонам симметрично фиксируют герметически по два капроновых винта 2. Снаружи резервуара 1 на двух противоположных сторонах приклеивают по две пластины 5 с вертикальным рядом отверстий в них. Длина пластин от поверхности дна резервуара равняется высоте блока 6 плюс 2-3 см. В противоположных боковых стенках резервуара 1 в верхней трети по центру выреза 3 в продольном его направлении укрепляют герметически электрод 4.
Вырезают прямоугольной формы стеклянную пластину 12. В ней по обеим плоским сторонам делают по восемь параллельных, прямоугольных, идущих в поперечном направлении каналов 14. Размеры каналов зависят от требований методики. Промежутки 13 между каналами должны составлять 3-5 мм. Ширина их произвольная, но должна обеспечивать герметичность между пластинами 8, 12, при их накладывании.
Каналы 14 на пластине 12 можно выполнять и следующим способом. Из стеклянной пластины толщиной 2-4 мм нарезают полоски шириной 3-5 мм и длиной, равной ширине пластины 12. Эти полоски наклеивают на пластине 12 в поперечном направлении (между широкими краями) параллельно одна другой на некотором расстоянии. По краям пластины 12 наклеивают по одной более широкой полоске (10-15 мм). Расстояние между наклеенными параллельными полосками будет шириной каналов, а толщина полосок — высотой. Для склеивания применяют эпоксидную смолу или другой подходящий клей. Вырезают две стеклянные пластины 8 и 11, размеры которых соответствуют размерам пластины 12. По длине они больше пластины 12 на удвоенную толщину пластины. Узкие края пластин 8 и 11 стачивают под углом 45°, как показано на чертежах. Для образования каналов пластины 8, 12, и складывают как показано на рис. 93, б. Для изготовления пластин 8, 12 и 11 используют стекло «пирекс» толщиной 8-10 мм. Если в пластине 12 каналы вырезают, то его толщина должна составлять 12-14 мм. Затем по высоте пластин 8 и 11 вырезают пластины из плексигласа 16 и 17. По длине они на 4 см больше пластин 8 и 11. Толщина их составляет 16-20 мм. Посередине этих пластин вырезают пазы 15, размеры которых соответствуют размерам пластин 8 и 11. В эти пазы пластины 8 и 11 должны, входить плотно. По узким сторонам пластин 16 и 17 просверливают симметрично по два отверстия для винтов 18, расположение которых в обоих пластинах идентично. Вверху к пластинам 16 и 17 приклеивают пластины-площадки 9, в которых просверливают отверстия 10. Расположение этих отверстий соответствует расположению винтов 2 в резервуаре 1, когда собран весь блок 6.
После изготовления всех деталей блока 6 их скрепляют барашковыми винтами 18. Затем верхние и нижние торцовые стороны блока отшлифовывают. Обозначают взаимное расположение всех элементов, в том числе их верх и низ. После разборки блока и последующей комплектации учитывают эти обозначения.
Стеклянную пластину 12 можно изготовить в нескольких вариантах с различными размерами каналов по ширине и толщине в соответствии с требованиями применяемой методики.
Когда необходима другая длина каналов, тогда изготовляют соответствующих размеров стеклянные и плексигласовые пластины. Таким образом заготавливается другой блок 6. Таких блоков тоже можно изготовить заблаговременно несколько. В эксплуатацию берут тот блок, который удовлетворяет требованиям данной методики. Заготовка нескольких блоков предусматривает беспрерывный электрофорез: когда идет электрофорез в первом блоке, подготавливают последующий блок и им сменяют первый блок по окончании электрофореза. Это приводит к увеличению производительности электрофоретического анализа.
Устройство в действии
Пластины 8, 12 и 11 моют соответствующим образом. Затем внутренние поверхности смачивают дистиллированной водой. На пластину 12 накладывают с обеих сторон пластины 8 и 11, находящиеся в плексигласовых пластинах 16 и 17 как показано на рис. 93, б. При этом торцовые поверхности всех пластин должны находиться в одной плоскости. Так как стекло гидрофильно, не нужно покрывать внутренние поверхности пластин с каналами для геля силиконовой смазкой. В таких условиях герметичность создается за счет микрослоя воды между ними. Образовавшийся блок из указанных пластин плотно скрепляют винтами. Таким образом образуется блок 6 с каналами для формирования в них геля. Дают возможность стечь дистиллированной воде из каналов 14 или для ускорения удаляют остаток воды с помощью полосок фильтровальной бумаги. Затем нижние отверстия каналов 14 закрывают по способу с применением устройства, изображенного на рис. 94. Каналы заполняют раствором полиакриламида. На его поверхность наслаивают определенное количество дистиллированной воды. После образования геля воду сливают и с помощью полосок фильтровальной бумаги удаляют остатки воды. Затем в пространство каналов над гелем вносят раствор образцов, др. реактивы и буферный раствор. На площадку, образованную пластинами 16, 11, 12, 8, 17, накладывают вакуумную резиновую прокладку с вырезом для каналов, и блок 6 закрепляют этой площадкой и площадками 9 в дне верхнего буферного резервуара против выреза 3 с помощью винтов 2 и гаек. В верхний резервуар заливают буферный раствор до покрытия электрода 4 плюс 2-3 см выше. Резервуар 1 с блоком 6 устанавливают под резервуаром 7, который перед тем заполняют наполовину буферным раствором. Верхний резервуар фиксируют На нижнем резервуаре с помощью отверстий в пластинах 5 и шпилек, вставленных в них на определенной высоте. При этом блок 6 должен быть погружен в раствор на 3-5 см. Верхний резервуар накрывают крышкой. Устройство помещают в холодильник, подводят к электродам постоянный ток и проводят электрофорез. Затем отключают ток, снимают верхний резервуар с блоком 6 с нижнего, сливают из него буфер, отсоединяют блок 6. Отвинчивают гайки с винтов 18. Отделяют пластины 8 и 11 от пластины 42. Гели из каналов в пластине 12 освобождают с помощью дистиллированной воды и тоненькой пластмассовой лопаточки; Их обрабатывают по соответствующей методике. Затем пластины.8, 12 и 11 моют, смачивают дистиллированной водой их внутренние поверхности и скрепляют в блок 6. Далее поступают как описано выше.
Способ и устройство для закрытия каналов для гелей в приборах для диск-электрофореза в полиакриламидном геле
Устройство (рис. 94) представляет собой прямоугольную емкость 1, по величине немного превышающую блок с каналами для геля 2. В емкости устанавливают небольшие бруски 3 один от другого на расстоянии, равном длине блока 2 с каналами для геля. В емкость 1 наливают расплавленный парафин 5 в таком количестве, чтобы уровень его поверхности был выше поверхности брусков 3 на 0,5-1,0 мм. Сразу же после заливки парафина в него погружают блок 2 с каналами для геля 4, устанавливая его на бруски. После затвердения парафина каналы заполняют раствором полиакриламида для образования геля. После гелеобразования блок легко снимается с парафина и используется для электрофореза.
Рис. 94. Устройство для закрытия каналов для гелей в приборах для диск-электрофореза в полиакриламидном геле: 1 — прямоугольная емкость; 2 —- блок с каналами для геля; 3 — бруски, на которые устанавливают блок, с каналами для геля; 4 — каналы для геля в приборе для электрофореза; 5 — расплавленный парафин
Для повторного использования парафин расплавляют непосредственно в емкости 1 и в него погружают блок с каналами для геля, как описано выше. Это ведет к дополнительной экономии времени.
Устройство для наслаивания дистиллированной воды на поверхность гелей из полиакриламида
С целью сокращения времени на выполнение трудоемкой и кропотливой операции наслаивания дистиллированной воды на поверхность образующегося геля из полиакриламида. Нами разработано устройство (рис. 95).
Устройство изготовляют из плексигласа. Склеивают камеру 4, которая имеет прямоугольную форму. В донной части ее делают два параллельных ряда отверстий 10 по форме и размерам каналов 2 прибора 11, в которых идет формирование геля. Схема расположения отверстий в дне камеры соответствует таковой расположения каналов в приборе. В отверстия 10 вклеивают футляры 8 из тонкого листового плексигласа. В эти футляры плотно вставляют фитили 9 из высококачественной хлопковой или льняной тканей. Можно фитили делать из другого пористого материала (фарфор, стеклянная вата, синтетические материалы и др.). К корпусу камеры приклеивают крышку 5. Ее можно и не приклеивать, а прикреплять герметически с помощью шурупов и резиновой прокладки. Посередине в крышке камеры делают штуцер 6, на который надевают трубку с зажимом 7. По бокам с наружной стороны камеры приклеивают фиксаторы 3, имеющие форму прямоугольников с отверстиями.
Фитили перед употреблением обрабатывают, чтобы они не отдавали минеральных и органических веществ при прохождении через них дистиллированной воды. Пористость фитилей должна обеспечивать просачивание через них 0,5 мл дистиллированной воды в течение 5-10 с при открытом зажиме 7.
Перед эксплуатацией камеру заполняют дистиллированной ванной водой. Зажимом 7 пережимают резиновую трубку на штуцере 6. В каналы 2 прибора 11 вносят раствор полиакриламида 1. Устройство для наслаивания фиксируют фиксаторами 3 на приборе 11 так, чтобы фитили 9 вошли в отверстия каналов 2. Прибор 11 вместе с устройством наклоняют под углом 40-45°. Зажим 7 снимают. Через фитили просачивается автоматически дистиллированная вода из камеры 4 на стенку каналов, а оттуда — на поверхность гелей.
Устройство для наслаивания-дозирования реактивов в приборах для диск-электрофореза в полиакриламидном геле
Нами разработано устройство, позволяющее автоматизировать и ускорить во много раз выполнение операции наслаивания-дозирования реактивов, а также повысить ее точность (рис. 96).
Рис. 96. Устройство для наслаивания-дозирования реактивов в приборах для диск-электрофореза в ПААГеле: а — общий вид устройства; б — вид сверху на панель с фиксированными на ней микропипетками и передвижной пластиной; 1 — микропипетки; 2 — панель; 3 — фиксаторы; 4 — регуляторы доз; 5 — передвигающаяся пластина; 6 — резиновые колпачки; 7 — направляющие стержни; 8— гайка-шкив; 9 — винт, фиксированный в пластине 9; 10 — шкив электромотора; 11 — электромотор типа «РД»Л; 12 — реле времени; 13 — капилляры; 14 — многоходовой кран; 15 — трехходовой кран; 16 — штуцер; 17 — сифон; 18 — резервуар для дистиллированной воды и воздуха под давлением; 19 — прибор для электрофореза в полиакриламидном геле, частичный вырез; 20— капилляры; 21 — каналы для геля; 21 — пробирка с раствором; 23 — проволочная пружина
Панель 2 изготовляют прямоугольной формы из листового плексигласа или другого подходящего материала. На ней параллельно в поперечном направлении укрепляют с помощью фиксаторов шесть и более микропипеток 1 с резиновыми колпачками 6.
Перед укреплением на нижние концы пипеток 1 надевают капиллярные полиэтиленовые трубки 20 длиной 4-5 см. Возле колпачка 6 каждой пипетки 1 на расстоянии 8-10 мм от конца пипетки на панели 2 укрепляют пружинный пластинчатый регулятор доз 4. С помощью входящего в его состав микровинта пластинчатая пружина может передвигаться перпендикулярно к поверхности колпачка 6 в прямом и обратном направлениях. При этом изменяется объем колпачка. Выше на 10-15 мм от регуляторов доз 4 посередине в панели 1 просверливают отверстие для винта 9. По обеим сторонам от него на одинаковом расстоянии параллельно краю панели просверливают отверстия для крепления в них направляющих стержней 7. Винт 9 жестко фиксируют в пластине 5 посередине. На одинаковом расстоянии от центра по сторонам в пластине 5 просверливают два отверстия, расположение которых совпадает с расположением стержней 7 на панели 2. Стержни свободно входят в эти отверстия. На стержни надевают пружины 23, Пластину 5 с фиксированным винтом 9 надевают на стержни 7 и вставляют в центральное отверстие в панели 2 для винта 9. На обратной стороне панели на винт 9 навинчивают гайку-шкив 8. Резьба винта 9 имеет очень малый шаг (ход). Рядом на панели на некотором расстоянии укрепляют маленький электромотор типа «РД» со шкивом 10 с малым! количеством оборотов в минуту. Шкивы 8 и 10 соединяют передачей. Диаметры шкивов делают такими, чтобы передвижение пластины 5 в направлении к панели 2 приводило к освобождению жидкости из пипеток 1 в количестве 10-80 мкл за 2-3 мин. Рядом с электромотором на панели укрепляют реле времени 12. В верхние отверстия пипеток 1 вставляют капилляры 13 из стекла или из нержавеющей стали. Мы в одном варианте использовали иглы от медицинских шприцов. Внешний диаметр капилляров должен быть таким, чтобы капилляр свободно входил во внутреннее отверстие пипеток 1. Капилляры герметически установлены в отверстие в резиновых колпачках 6. Капилляры соединяют герметически трубочной системой (из полиэтилена, резины) с многоходовым краном 14, трехходовым краном 15 и посредством штуцера 16 и сифона 17 с резервуаром 15 для дистиллированной воды и воздуха под давлением.
Устройство в действии
С помощью шкива 8 пластину 5 передвигают в рабочее положение, при котором сдавливаются резиновые колпачки 6 приблизительно наполовину. Аналогично регуляторы доз 4 с помощью микровинтов отводят в рабочее положение, при котором они наполовину сдавливают резиновые колпачки 6. При перекрытом кране 15 резервуар 18 наполняют наполовину дистиллированной водой и создают некоторое давление в нем воздуха. Кран 14 ставят в нерабочее положение. Краном 15 соединяют сифон 17 с краном 14. Последним соединяют капилляр 13 первой пипетки 1 с краном 15, а посредством него — с сифоном 17. Промывают дистиллированной водой внутреннее отверстие первой пипетки. Затем поочередно таким же образом с помощью крана 14 промывают дистиллированной водой остальные пипетки 1. После этого краном 15 соединяют кран 14 со штуцером 16, отсоединяя при этом сифон 17. Краном 14 соединяют поочередно капилляры 13 с краном 15, а посредством него — со штуцером 16. Воздухом из резервуара 18 таким образом поочередно продувают внутренние отверстия пипеток 1 для освобождения их от остатков дистиллированной воды.
Краны 14 и 15 ставят в нерабочее положение. В пробирках 22 подготавливают реактивы для наслаивания-дозирования на поверхность геля в каналах 21 прибора для электрофореза 19. Пробирки 22 в штативе подставляют под пипетки 1. Капилляры 20 погружаются при этом в реактивы в пробирках 22. С помощью шкива 8 перемещают пластину 5 в направлении нерабочего положения, т. е. от панели. В результате вакуума реактивы из пробирок 22 поступают в пипетки 1 до верхней метки градуированной части и немного выше. С помощью регуляторов доз 4 отрегулировывают уровень жидкости в пипетке на верхнюю метку. Затем штатив с пробирками 22 убирают. Под пипетки 1 подводят прибор 19 так, чтобы в каждый канал 21 погружался отдельный капилляр 20 пипетки 1 на определенную глубину. Прибор 19 ставят под углом 30-40° для того, чтобы на нижнюю стенку упирались капилляры 20. Реле времени ставят на 2-3 мин. Включают электромотор 11. Шкив 10 посредством передачи приводит в движение шкив 8. Последний притягивает винт 9, а вместе с ним — и пластину 5 в направлении к панели 2. Пластина 5 прижимает одновременно все шесть и более резиновых колпачков к панели 2. При этом уменьшается их внутренний объем. Под действием находящегося в них воздуха из пипеток 1 реактивы вытесняют на стенку каналов 2, а оттуда — на поверхность геля или других жидкостей. Подобранное эмпирически время работы электромотора по реле позволяет вытеснить установленную дозу реактива. После окончания наслаивания прибор 19 осторожно убирают из-под устройства для наслаивания-дозирования. Пипетки 1 промывают дистиллированной водой из резервуара 18, продувают воздухом с помощью кранов 141 и 15 как описано выше при подготовке устройства к эксплуатации. Устройство готово к последующей работе.
