Эмиссионные спектральные методы
Принципы методов
Атомы химических элементов — металлов, присутствующие в растворе в виде солей, попадая в раскаленный газ горячего пламени, теряют часть внешних электронов, превращаясь в положительно заряженные ионы. Электроны остаются в той же среде, суммарный заряд которой, таким образом, нейтрален. Этот газ физики называют плазмой. В высокотемпературной плазме кинетическая энергия движения ионов находится в равновесии с их внутренней энергией, т.е. все время находятся такие ионы, скорость движения которых замедляется При этом один или несколько электронов внутри атома переходит на более высокий энергетический уровень – в возбужденное т.е. более богатое энергией квантовое состояние. Спустя некоторый, очень небольшой промежуток времени электроны возвращаются в прежнее состояние, и излучается квант света.
Если пламя освещается светом с соответствующей длиной волны, события могут идти в обратном направлении – ион поглощает квант света, переходя в возбужденное состояние. Практически в раскаленной плазме оба процесса находятся в равновесии, т. е. число ионов металлов, которые переходят в возбужденное состояние, равно числу тех, которые возвращаются в обычное.
Возможные энергетические уровни атомов, их так называемые квантовые состояния, строго детерминированы, различия между ними в точности равны энергии кванта поглощенного или излучаемого света, которая однозначно связана с длиной волны. Поэтому переход из одного энергетического состояния в другое сопряжен с испусканием или поглощением света совершенно определенной, строго фиксированной длины волны. Поскольку в составе большинства атомов много электронов, теоретически возможно большое число разных энергетических уровней (т. е. разных степеней возбуждения атома), соответственно, атом может излучать свет с разными длинами волн. Однако при реальных температурах пламени в аналитических приборах речь идет только об одном, самом низком, уровне возбуждения, а, следовательно, и об одной длине волны излучаемого или поглощаемого света.
Способность находящихся в плазме ионов испускать и поглощать кванты света используется в двух аналитических методах – пламенной фотометрий и атомной абсорбциометрии. В первом случае речь идет об эмиссии (излучении) света, во втором – о его поглощении. Спектральные методы – и фотометрия пламени, и атомная абсорбция – позволяют определить общее содержание элемента в исследуемой пробе независимо от того, в какой форме он находится: свободной, связанной с белком или низкомолекулярным веществом и т.д. В этом заключается принципиальное различие результатов спектроскопического и потенциометрического (ионоселективного) методов исследования. Одновременно это большое преимущество спектроскопического метода, поскольку полученные результаты в большей степени являются абсолютными, так как спектральная линия элемента – его физическая константа, которая может быть определена очень точно, в то время как измеренная потенциометрическим методом активность иона, во-первых, всегда меньше общей концентрации и, во-вторых, зависит от большего числа привходящих обстоятельств.
В связи с ранее сказанным на международном уровне существует договоренность считать эталонным (референтным, справочным) методом спектроскопический и калибровать ионоселективные электроды по его данным. Иными словами, при измерении натрия и калия потенциометрическим методом прибор должен выдавать такие же результаты, какие получились бы, если бы исследование выполнялось методом фотометрии пламени или атомной абсорбции. В случае сомнения в работе ионоселективного электрода или калибровочного раствора, по которому этот электрод калибруется, ориентиром должен быть результат спектрального метода.
Пламенная фотометрия
Находящиеся в раскаленной плазме ионы атомов, переходя из возбужденного состояния в невозбужденное, излучают свет, состоящий из одной или нескольких узких спектральных линий разной интенсивности (это зависит в основном от температуры), что визуально воспринимается как окрашивание пламени., Длина волны испускаемого света зависит от структуры электронной оболочки атома и отражает химическую природу элемента. Так, линия натрия имеет длину волны 589 нм, и он окрашивает пламя в желтый цвет, магний — в красный, калий в – фиолетовый, рубидий – в красный, марганец – в голубой. Если в пламени присутствует несколько элементов, более интенсивная линия делает менее интенсивные практически невидимыми, что, конечно, создает помехи при анализе. Помехи возникают и вследствие диффузного, или фонового свечения, которое наблюдается на месте линии и в отсутствие излучающего ее иона. Количество ионов в пламени невелико, а среди них возбужденные составляют лишь несколько процентов, однако этого достаточно, чтобы выполнить измерения. Прибор, который позволяет использовать эмиссию (свечение) плазмы для определения концентраций в ней излучающих химических элементов, называется пламенным фотометром.
Устройство пламенного фотометра
Пламенный фотометр состоит из следующих элементов: системы подачи газов – горючего газа и поддерживающего горение окислителя воздуха или воздушно-кислородной смеси, распылителя – эжектора (смесителя), горелки, монохроматора (светофильтра), фотоприемника, измерительного устройства (рис. 1.10).
Рис. 1.10. Схема устройства пламенного фотометра: 1 – аспиратор; 2 – распылитель; 3 – пламя горелки; 4 – щель на входе; монохроматор (светофильтр); 6 – щель на выходе; 7 – детектор; 8 – измерительный прибор
Система подачи газа состоит из линии горючего газа и линии воздуха. В качестве горючего газа можно использовать бытовой газ – метан, но он не дает высокотемпературного пламени, что очень ограничивает перечень определяемых элементов. Бутан или пропан обеспечивает более высокую температуру, но самое горячее пламя получается при сгорании ацетилена. Горючий газ поступает в прибор из баллона через систему редукторов давления и, если это необходимо, очистки. Воздух обычно поступает из компрессора, но его источником могут быть и баллоны с соответствующей системой редукторов.
Для обеспечения равномерного свечения пламени надо поддерживать давление и горючего газа, и воздуха с высокой точностью, чтобы не повторять регулировку прибора и не переделывать калибровку.
Работая с пламенным фотометром, нельзя забывать, что это источник повышенной опасности, неправильное обращение с которым может привести к пожару или даже взрыву. Включая прибор, надо сначала включить воздушную магистраль, а затем рее газовую, иначе газ может проникнуть в воздушную систему и, смешиваясь с воздухом, образовать взрывоопасную смесь.
Раствор, содержащий исследуемое вещество, всасывается в поток воздуха или воздушно-кислородной смеси с помощью эжектора. По принципу работы эжектор напоминает пульверизатор: он всасывает исследуемый раствор и распыляет его с образованием множества мелких капелек. Большая часть их тут же оседает на стенках, накапливается на дне сосуда и удаляется через водяной запор. Последний обеспечивает небольшое превышение давления воздуха в распылителе над давлением газа, благодаря чему воздух и поступает в горелку. Если этой разности давлений нет, газ из горелки может проникнуть в распылитель, где накопится взрывоопасная смесь. Поэтому, работая с прибором, надо все время следить, чтобы водяной запор был заполнен. Небольшая часть (5-10%) исследуемого материала в виде очень мелкой взвеси поступает в горелку, где смешивается с горючим газом. Этого вполне достаточно, чтобы создать интенсивное свечение.
В спектре излучаемого горелкой света на общем фоне видны узкие спектральные линии исследуемых элементов, ширина каждой из которых зависит от условий возбуждения и составляет несколько нанометров. Свет нужных линий выделяется монохроматором или с помощью светофильтров и попадает на фотоприемник, регистрирующий его интенсивность. Необходимость в этом возникает потому, что, во-первых, в исследуемом материале обычно присутствует несколько химических элементов, спектральные
линии которых могут оказаться достаточно близко друг от друга, а во-вторых, это фоновое свечение, т.е. то, которое наблюдается в отсутствие исследуемого элемента на месте его линии. Чем уже спектральный участок, который выделяет монохроматор, тем меньше суммарная интенсивность фонового свечения и, соответственно, меньше помех в работе. В идеальном случае монохроматор должен выделять только участок, который соответствует ширине измеряемой спектральной линии, т.е. несколько нанометров.
Очень часто пламенные фотометры представляют собой двухканальные приборы, поскольку они предназначены для одновременного определения концентрации ионов натрия и калия в биожидкостях.
Существует несколько возможных схем работы пламенного фотометра: прямой способ определения концентрации электролитов, компенсационный и с внутренним стандартом.
В самом простом, прямом способе, который обычно используют при определении натрия или калия в сыворотке крови или моче, исследуемый материал разводят водой в 50 или 100 раз и сжигают в пламенном фотометре. Эмитируемый свет, проходя через светофильтр, попадает на фотоприемник, сигнал которого пропорционален количеству исследуемого элемента. Такое прямое измерение оказывается эффективным только при таком условии, когда исследуемого элемента много и у него яркие линии, как в случае натрия. Если же концентрация исследуемого вещества невелика по сравнению с содержанием других элементов, спектральные линии которых более интенсивны и создают помехи при анализе, необходимо использовать более сложные приемы. Эффективнее всего, конечно, иметь монохроматор, выделяющий узкую спектральную полосу, в точности соответствующую ширине линии, но такие монохроматоры дороги, светосила у них обычно невелика, поэтому необходимы более чувствительные и, соответственно, более дорогие светоприемники.
Используя компенсационный метод, одновременно выделяют два пучка света – один, который соответствует линии исследуемого элемента, второй – того элемента, который мешает определению, поскольку излучаемый им интенсивный свет создает помехи (для биологических жидкостей в таком положении оказывается натрий). Оба сигнала включаются навстречу друг другу, прибор фиксирует разность между ними, тем самым вводя поправку на концентрацию присутствующего в растворе натрия.
Метод внутреннего стандарта состоит в разведении исследуемой биологической жидкости не водой, а раствором элемента, которого нет в биологическом материале, чаще всего солями лития. В процессе анализа делают два измерения: на длине волны, характерной для линии определяемого элемента, и на длине волны линии внутреннего стандарта. Если показания стандарта отличаются от того, которое было при калибровке, вносят соответствующую поправку и в измеряемую величину. Такой порядок работы позволяет избежать ошибок, связанных с нестандартными условиями распыления; нестабильностью режима сгорания аэрозоля, различием состава анализируемого и стандартного растворов. Особенно важно это при исследовании жидкостей, вязкость которых может значительно колебаться.
Точность пламенно-фотометрических методов исследования во многом зависит от условий распыления исследуемой жидкости и возбуждения пламени. Чтобы их стандартизировать, надо не только хорошо отрегулировать распылитель, но и проследить, чтобы вязкость калибровочных и исследуемых растворов была одинаковой. Для этого в разводящие растворы рекомендуется добавлять соответствующие вещества. Натрий и калий возбуждаются значительно легче остальных, и характерные для них линии спектра излучения четко отделены друг от друга. В случае применения пламени с более высокими температурами и более чувствительных регистрирующих устройств возможно провести анализ до 50 элементов.
Помимо указанных выше основных частей лрибор может быть снабжен различными сервисными устройствами: электрическим зажиганием газа, системой автоматической подачи и разведения проб, печатающим устройством и др.
Область применения пламенной фотометрии в клинической лабораторной диагностике
Этим методом чаще всего определяют ионы калия и натрия в сыворотке крови, моче, эритроцитах, спинномозговой жидкости, экссудатах, транссудатах, в желудочном соке; иногда измеряют содержание кальция и лития. Для одновременного определения натрия и калия нет необходимости использовать ни методы внутреннего стандарта, ни компенсации, достаточно правильно приготовить комплексный калибровочный раствор, который одновременно содержит и калий, и натрий в концентрациях, близких тем, которые бывают в исследуемом материале. Нельзя только забывать, что в плазме крови соотношение концентраций этих элементов другое, чем в моче, поэтому калибровочный раствор для мочи не подходит для анализа крови, и наоборот.
Определение электролитов методом пламенной фотометрии характеризуется высокой надежностью, чувствительностью, простотой и быстротой выполнения (в течение нескольких минут) и считается референтным методом для определения натрия и калия. Однако опасность работы с горючими и взрывоопасными газами и системами все чаще приводит к замене этих приборов микроанализаторами ионов с ионоселективными электродами.
Атомная абсорбционная спектроскопия (ААС)
Атомная абсорбционная спектроскопия, или атомная абсорбциометрия, – метод, в известном смысле, обратный пламенной фотометрии, поскольку здесь измеряют не излучение пламени (раскаленной плазмы), а, наоборот, поглощение им света. Однако физические основы и того, и другого — одни: очень избирательное взаимодействие иона в газовой фазе с квантом света. Оно заключается в том, что атомы каждого химического элемента поглощают и испускают только кванты света с определенной длиной волны. Поэтому, если через пламя проходит белый свет (например, солнечный или от лампы накаливания), на спектрограмме будут заметны узкие темные полосы – линии, соответствующие спектральным линиям присутствующих в пламени элементов. Именно этим объясняются узкие, темные полосы в солнечном спектре – так называемые фраунгоферовы линии. Преимущество ААС перед фотометрией пламени заключается в том, что это – фотометрический процесс, подчиняющийся закону Ламберта-Бера, он лучше воспроизводим, меньше подвержен действию помех и поэтому точнее.
Устойчивость к помехам объясняется еще и тем, что измеряется именно количество прошедшего света, поэтому, если его источник – монохроматический, излучающий только свет определенной длины волны, посторонние ионы не мешают определению: они могут поглотить только тот свет, которого в данном источнике нет. Это позволяет определять методом ААС самые незначительные примеси элементов в присутствии значительных концентраций веществ, которые сделали бы измерение методом пламенной фотометрии невозможным.
Устройство атомно-абсорбционных спектрофотометров
Схема таких спектрофотометров представлена на рис. 1.11. В методе атомной абсорбциометрии источником света служит лампа с полым катодом, который выполнен из элемента, подлежащего исследованию. Таким образом, катоды должны быть разными в зависимости от анализируемого элемента. В некоторых случаях в мультиэлементных лампах катоды изготавливают из сплавов различных металлов. Лампы заполняют аргоном, неоном под низким давлением.
Рис. 1.11. Схема устройства атомно-абсорбционного спектрофотометра: 1 – катод; 2 – прерыватель; 3 – пламя горелки; 4 – щель на входе; 5 – монохроматор; 6 – щель на выходе; 7 – детектор; 8 – измерительное устройство
Аргоновые лампы дают накал от голубого цвета до красного, неоновые – от красного до оранжевого. Во время работы в лампе идет электрический разряд, который возбуждает эти атомы. Когда атомы металла сталкиваются с газом – неоном или аргоном, теряют энергию, и при этом возбуждается их собственное свечение. В результате излучается свет точно той длины волны, которая нужна для данного исследования. Например, для определения натрия, ионы которого, попадая в плазму, излучают и поглощают свет с длиной волны 589 нм, используют натриевую лампу излучающую свет именно с такой длиной волны; для кальция – 422,8 нм. Это известное неудобство метода – необходимость своей лампы для каждого химического элемента – компенсируется другими его преимуществами.
Практически оказывается, что метод ААС почти в 100 раз чувствительнее пламенной фотометрии и более избирателен. Существует два способа перевести исследуемый элемент в газовую фазу для исследования. В первом случае, так же, как и в пламенной фотометрии, используют горелку, в которой газы – водород и воздух – смешиваются с пробой в пламени. Исследуемое вещество распыляется в воздушный поток, с которым и поступает в горелку. Преимущество этого метода – более высокая температура и концентрация исследуемого вещества, недостатки – относительно большие капли воды, попадая в пламя, увеличивают количество рассеянного света, так называемый, «шум сжигания».
Меньшие помехи от фона получаются в случае использования горелки с предварительным смешиванием газов и распылением пробы перед сжиганием. В результате происходит сброс больших капель, а в пламя поступает проба, очень мелко распыленная. Путь пробы в пламени этой горелки больший, чем в предыдущем варианте, результатом чего являются большие величины светопоглощения и чувствительность измерения.
Недостатком горелок, с предварительным смешиванием является меньшая температура пламени, некоторые металлокомплексы неадекватно диссоциируют, например комплексы кальция с фосфатом. Существует еще один вариант пламенных горелок – горелки с окисью азота и предварительным смешиванием. Они дают очень высокую температуру плазмы, многие комплексы кальция диссоциируют при этой более высокой температуре и кальций возбуждает очень сильное свечение, что тоже может создавать проблемы.
В технологии, так называемой «беспламенной атомной абсорбции», использован углеродный стержень или «графитовая горелка». Исследуемое вещество вносится в нагретую электричеством до высокой температуры графитовую трубку под вакуумом, которая в этом случае играет роль газовой кюветы (графитовая кювета), могут быть использованы также полоски тантала. При повышении температуры графитового стержня или танталовых стрипов проба высушивается, сжигается и распыляется в камеру.
Область применения атомно-абсорбционной спектроскопии в клинической лабораторной аналитике
Данный метод используют для определения концентрации микроэлементов и редких элементов в различных биологических жидкостях и тканях, при токсикологических исследованиях. Его применяют в централизованных и специализированных отделениях диагностических центров, токсикологических лабораториях для определения общего кальция, железа, меди, хрома, кобальта, селена, свинца (для хрома, селена, свинца и кобальта рекомендуется беспламенная техника), молибдена, лития, ртути, цинка, мышьяка и др. Атомно-абсорбционный метод определения кальция в сыворотке крови утвержден в качестве референтного Международной федерацией клинической химии и лабораторной медицины.
