Ферменты как аналитические реагенты
Специфичность действия, высокая активность в минимальных количествах вещества, способность многократного участия в реакции, отсутствие токсичности делает ферменты весьма привлекательным видом реагентов для клинических лабораторий. Их применение позволяет значительно упростить многие аналитические процедуры и сделать их экологически более чистыми, поскольку ферментативные методы не нуждаются в едких или летучих реагентах и высокой температуре реакции. Особенно удобно применять их в автоматических анализаторах, использующих фотометрию в качестве завершающего этапа, так как при этом можно обойтись легко автоматизируемыми операциями: отмериванием, инкубацией и фотометрией.
ферменты как реагенты используют в качестве вспомогательных и индикаторных ферментов в энзиматических тестах, а как специфические катализаторы – при количественном определении различных аналитов, включая ионы.
Ферментные реагенты в клинической лаборатории применяют практически только в форме готовых наборов реактивов промышленного изготовления. Можно выделить несколько видов этих реактивов: используемые для проведения ферментативной реакции в жидкой среде; иммобилизованные на носителях ферменты для проведения реакций в растворах электрохимическими методами – биосенсоры; ферменты – реактивы в лигандных технологиях, например в иммуноферментных методах; «сухая» химия.
В случаях использования ферментов в составе смеси реактивов это могут быть сухие порошки, полученные путем лиофилизации. Перед употреблением их необходимо растворить в предписанном инструкцией объеме воды, обычно в том же флаконе, в котором упакован порошок. Срок годности растворенного реактива значительно меньше, чем сухого порошка. Наличие в воде солей металлов, органических примесей, которые могут тормозить или, наоборот, катализировать некоторые нежелательные ферментные реакции, обусловливает требования к качеству воды, используемой в лаборатории, для выполнения которых необходимо приобретение аппаратуры для эффективной очистки воды от возможных примесей.
Более надежны жидкие реактивы, поскольку их качество гарантировано изготовителем и реактивы готовы к применению, так что исключена ошибка разведения. Задача лаборанта или медицинского технолога заключается в том, чтобы слить, как правило, два жидких реактива в соответствующей пропорции. Такие высокоспецифичные ферменты, как уриказа, уреаза и глюкозо- оксидаза широко используют в наборах реагентов для соответствующих рутинных исследований содержания мочевой кислоты, мочевины и глюкозы.
Применение менее специфичных ферментов становится также возможным за счет использования ферментных аналитических систем, основанных на сопряженных реакциях, причем первый из ферментов может обладать лишь относительной специфичностью (например, гексокиназа в системе для определения глюкозы способна превращать в 6-фосфорные эфиры наряду с глюкозой ц другие сахара), а второй фермент обеспечивает специфичность общего результата исследования (в данном примере эту специфичность обеспечивает глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа).
Использование нескольких ферментов в качестве последовательных этапов исследования основано на их хорошей совместимости в реакционной среде.
Многие химические методы определения метаболитов дают завышенные результаты, так как присутствующие в сыворотке соединения со сходной структурой реагируют аналогично определяемому метаболиту. Например, в методе определения пирувата основанном на образовании гидразона с 2,4-динитрофенилгидразином, другие кетокислоты, встречающиеся в сыворотке, реагируют так же, как пиру ват, что приводит к завышению результатов определения пирувата.
Специфичность действия ферментов как реагентов позволяет при их применении не подвергать исследуемую биологическую жидкость предварительной очистке, которую обычно проводят во избежание интерференции. Так, определение пирувата по реакции с НАДН с использованием в качестве катализатора фермента лактатдегидрогеназы является специфичным только для пиррата.
К другим метаболитам, которые определяют с применением ферментов как катализаторов, относятся АТФ, АДФ, АМФ, этанол, глюкоза, а-кетоглютарат, мочевина, мочевая кислота, холестерин, креатинин, триглицериды, известны ферментативные методы для билирубина, ионов – натрия, калия, хлоридов, магния и железа. Фотометрические принципы измерения в этих методах исследования аналитов те же, что и перечисленные выше принципы фотометрических измерений активности ферментов.
Наиболее широко применяют методы исследования, в которых определяют количество продуктов катализируемой ферментом реакции по достижении равновесия – методы «конечной точки». Оптимальными вариантами таких реакций являются те, при которых происходит практически полное превращение субстрата в метаболит. Если такое полное превращение на первом этапе реакции не достигается, можно дополнительно с помощью подходящего фермента выполнить преобразование первоначального продукта во вторичный, что позволяет уже полностью обеспечить измерение всего количества исследуемого субстрата.
Классическими примерами ферментативных методов определения аналитов в конечной точке реакции являются методы определения глюкозы после ее гидролиза глюкозооксидазой на основе колориметрической реакции Триндера с 4-аминофеназоном ГОД-ПОД-ПАП. Это реакция, основные компоненты реактивов для которой — глюкозооксидаза (ГОД), пероксидаза (ПОД).
4-аминофеназон и фенольное соединение: p-D-глюкоза + Н202 + о2–ГОД-D-глюконовая кислота + Н202; Н202 + 4-аминофеназон + оксибензолсульфо-нат – ПОД -> хинониминовый краситель + Н20. Образующийся краситель имеет розово-красное окрашивание, оптическая плотность которого измеряется при длине волны 540 нм.
«Двуточечные» кинетические методы теоретически точнее методов «конечной точки», однако они более требовательны к соблюдению постоянства условий реакции – pH, температуре и количеству фермента. Сохранение такого постоянства условий реакции облегчается выполнением исследований на автоматических анализаторах.
При определении метаболитов ферментативными методами количественную оценку результата можно проводить фотометрическим или электрохимическим способом, причем в качестве непосредственного объекта количественной оценки целесообразно использовать содержание относительно простого продукта, образующегося в процессе различных аналитических процедур. Значительная часть ферментативных методов заканчивается либо определением пероксида водорода, либо измерением концентрации НАДН или НАДН(Ф), т.е. наиболее универсальных продуктов биологического окисления. О количестве образовавшегося пероксида водорода можно судить либо по потреблению кислорода, служащего источником ее образования, либо непосредственно определяя само вещество. Такую возможность предоставляют электрохимические методы, которые будут рассмотрены далее.
Фотометрические методы, основанные на способности пероксида водорода в присутствии ПОД окислять бесцветные органические соединения с образованием ярко окрашенных продуктов, применяют значительно чаще. Известно много вариантов этого метода, используемого для различных аналитов.
Так как молярные показатели поглощения НАДН и НАДН(Ф) хорошо известны, некоторые производители наборов реактивов предлагают использовать в кинетических методах способ расчета результатов, не нуждающийся в калибровочном графике, при котором изменение величины оптической плотности в минуту умножают на заранее известный коэффициент (фактор). Этот подход связан с необходимостью строгого соблюдения условий выполнения реакции, состава среды и длины волны, поскольку только для таких условий действителен предлагаемый в инструкции к набору реактивов фактор. Для уверенного его применения рекомендуется тщательно проверять результаты, используя контрольные сыворотки.
Хотя для выполнения исследований требуется относительно небольшое количество ферментного белка, высокая стоимость хорошо очищенных препаратов ферментов несколько ограничивает сферу их рутинного применения в тех случаях, когда нет возможности использовать микроанализ. Сократить расход ферментных реактивов можно за счет уменьшения объема пробы и размера фотометрической кюветы, что возможно в автоматических анализаторах, но довольно затруднительно при ручной работе из-за сложностей операций с микрообъемами биологического материала.
Более экономным способом применения ферментов в клиническом лабораторном анализе представляется их иммобилизация на том или ином носителе, что позволяет полностью использовать их способность многократно, не разрушаясь, катализировать необходимый для анализа процесс превращения субстрата. Для иммобилизации чаще всего применяют такие ферменты, как гексокиназа, уреаза, глюкозооксидаза, трипсин, лейцинаминопептидаза, а-амилаза.
Иммобилизованные ферменты стабильнее, чем ферменты в растворе, по отношению к нагреванию и другим способам инактивации, однако некоторые их свойства, например оптимум pH, могут изменяться. Такие ферменты рациональнее всего использовать в аналитических системах, которые предназначены для прямого определения искомого аналита без дополнительного включения сопряженных ферментов и коферментов. Количественная оценка результатов катализируемых в этих системах реакций может экономично осуществляться с помощью потенциометрических, полярографических или микрокалориметрических устройств.
Нередко ферменты наносят на поверхность ионоселективного электрода, с помощью которого измеряют количество иона, участвующего в катализируемой ферментом реакции (например, чувствительный к кислороду электрод, покрытый слоем, содержащим глюкозооксидазу, измеряет содержание глюкозы в растворе по количеству кислорода, использованного в реакции окисления глюкозы; аммонийчувствительный электрод может быть совмещен с мембраной, содержащей уреазу). Эта схема применения иммобилизованных ферментов является одним из вариантов их включения в состав биосенсоров. Иммобилизованные ферменты служат одним из важных компонентов аналитических систем одноразового использования: диагностических полосок, многослойных аналитических элементов, некоторых иммунохроматографических тест-кассет. Ферменты используют в качестве меток при проведении иммуноферментных исследований.
