Фотометрические и колориметрические методы

Большинство элементарных веществ органических макромолекул могут образовывать при наличии определенных реактивов окрашенные соединения и комплексы. В зависимости от количества реактивного вещества, присутствующего в той или иной среде, образуется окраска, отличающаяся большей или меньшей интенсивностью. Сравнивая интенсивность окраски какого-либо образца с окраской раствора, в котором исследуемое вещество находится в известной концентрации, можно оценить количество содержимого в образце вещества.

Аналитические методы, основанные на сравнении интенсивности окраски растворов различных концентраций, называются колориметрическими методами.

До того как перейти к описанию метода колориметрического анализа необходимо напомнить смысл ряда понятий. Так, например, техника работы при этом методе состоит в сопоставлении «интенсивности» окраски ряда растворов. Это означает, что по сравнению с менее интенсивно окрашенным раствором, более «интенсивно» окрашенный раствор удерживает большее количество падающего света. По существу поглощение падающих излучений является абсорбцией последних, происходящей за счет преобразования световой энергии в химическую или тепловую энергию. Абсорбционный процесс – это процесс селективный в том смысле, что каждый тип молекулы поглощает излучения, характеризующиеся определенной длинной волны. Для того, чтобы имело место то или иное абсорбционное явление, лежащее в основе методов, неправильно называемых «колориметрическими», необходимо создать условия для селективной абсорбции. Иначе говоря, система реакции должна быть подвергнута облучениям, длина волны которых соответствует максимальной абсорбции, характерной для анализируемых молекул.

Падающие излучения. Любой источник излучения состоит из ряда простых или монохроматических излучений. Эти последние возникают вследствие изменения энергетических уровней периферических электронов атома, если этот последний подвергается активирующему воздействию (высокие температуры, электрическое напряжение и др.) Переход электрона с одной орбиты атома на другую, более центральную, сопровождается выделением известного количества энергии (квант или фотон). Общий поток фотонов, излучаемых элементом в состоянии колебания, образует монохроматическое излучение.
Каждый тип атомов отличается характерным расположением периферических электронов, вследствие чего перераспределение этих электронов ведет к выделению точно установленных количеств энергии, соответствующих расположению электронов, характеризующему соответствующий атом. Это означает, что благодаря возбуждению каждый тип атома вызывает появление определенного монохроматического излучения, различающегося  энергией фотона, длиной волны излучения, частотой и соответствующим периодом.

Атомы содержат различное число периферических электронных оболочек, причем переход атома с внешней орбиты может происходить как на ближайшую орбиту, так и на какую либо другую, расположенную ближе к центру. В последнем случае, выделяемая энергия отличается от энергии излучаемой тогда, когда электронный скачок имеет место между двумя соседними орбитами. В зависимости от числа электронных оболочек отличается также число возможностей испускания излучаемых волн. Это «волновое число» также характерно для каждого атома.
В качестве примера ниже приводятся характеристики излучения резонансных ртутных атомов:

Энергия фотона: 4,9 eV (или 18,7.10“20 кал или 7,8.10“12 эрг)
Волновое число 3,94.10“4 СМ-1 Период: 8,5.10-16 сек.
Частота: 1,18.1015 сек-1 Длина волны: 2 537 А

Для того чтобы дополнить характеристику соответствующего излучения к вышеприведенным величинам необходимо добавить также указания, касающиеся его количества, а также относительно интенсивности волны. Согласно определению интенсивность излучения является энергией транспортируемой в единицу времени. В области фотохимии, для того чтобы избежать трудоемких расчетов, интенсивность предпочитают измерять и оценивать на уровне облучаемой поверхности (препарат), причем результат относится к известному элементу этой поверхности. Определенная таким образом интенсивность облучения представляет собой «плотность потока», т.е. «энергетическое освещение». Оно выражается в ваттах на см2 или эргах на см2 в секунду или, реже, в фотонах на см2 в секунду.

Большинство падающих излучений, применяемых в фотометрии, являются однако комплексными, содержащими значительное количество монохроматических излучений, обладающих различными длинами волн и интенсивностями.

Комплексные излучения определяются энергетической спектральной кривой (рис. 2) отражающей соотношение между интенсивностями и длиной волны составных монохроматических излучений.
Эта кривая строится отсекая на абсциссе (х) длину волны (X), а на ординате (у) – соотношение между интенсивностью и длиной волны. Соединяя образующиеся точки получается непрерывная прямая, указывающая на спектральную непрерывность комплексного излучения. В то же время, эта кривая показывает, что в соответствующем излучении существуют монохроматические компоненты с различными длинами волн, интенсивности которых неодинаковы. Интенсивность Х2 вдвое больше чем соответствующая интенсивность X*, вследствие чего щ кривой наблюдается появление максимума. Обычно, в случае того или иного элемента максимум спектральной кривой изменяется в зависимости от интенсивности возбудителя. Однако, длина волны, соответствующая этому максимуму, будет всегда тождественной (рис. 3).

Рис. 2 . Спектральная энергетическая кривая комплексного излучения.

Рис. 3. Энергетические спектры для различных температур (тунгстеновая нить).

Селективная абсорбция. Как уже было указано, «стимулируемый атом» может излучать энергию за счет перемещения электрона на более центральную орбиту. Излучение одного кванта излучаемой энергии сопровождается уменьшением энергии W атома на количество, соответствующее излученному кванту.
Эта активация атома представляет собой квантифицированное явление в том смысле, что атом может удерживать (абсорбировать) лишь только те падающие кванты, которые располагают энергией, соответствующей энергетическим разницам между различными энергетическими уровнями рассматриваемого атома.

Следовательно, атомное поглощение за счет активирования является, по существу, селективным процессом, точно также как и атомное излучение. Иначе говоря, данный атом сможет абсорбировать лишь те излучения, длина волны которых соответствует его энергетическим уровням.

Аналогичный процесс происходит также и в случае молекул. И в этом случае абсорбция является селективной, причем ограничение излучений, которые могут быть абсорбированы, определяется энергетическими уровнями составных атомов. Однако, следует отметить, что молекулы обладают дополнительными энергетическими уровнями за счет наиболее поверхностных электронов компонентных атомов. Эти электроны сгруппированы, обеспечивая таким образом химические свойства молекулы. Следовательно, в случае молекул селективная абсорбция выражается суммой абсорбции соответствующих составляющих атомов, к которой добавляется селективное поглощение благодаря совмещаемым электронным оболочкам этих атомов.

После того как мы напомнили эти понятия, можно перейти к изложению колориметрических методов.

Принцип колориметрического метода

В основе принципа колориметрического метода лежит закон Ламберта-Беера, согласно которому в одинаковых условиях слой вещества той же толщины поглощает одинаковое количество падающего света. Поглощение света зависит как от природы находящихся в растворе абсорбирующих молекул, так и от числа молекул, встречаемых световым потоком (толщина слоя раствора). Таким образом, если отметить через  исходную интенсивность света и через i интенсивность света при выходе из раствора, мы получаем следующее выражение:

i = I*e_k'n

где к – удельный коэффициент абсорбции соответствующего раствора; е – основание натуральных логарифмов.

В этом уравнении k известно под названием коэффициента затухания. Толщина слоя п раствора зависит как от толщины е проходимого раствора, так и от концентрации с абсорбирующих молекул.

Следовательно, оптическая плотность D пропорциональна концентрации абсорбирующих молекул и толщине проходимого раствора.

Кроме того, из математического выражения закона Ламберта-Беера следует, что соотношение i/I между интенсивностью проходящего через раствор света и интенсивностью исходного света не зависит от абсолютной интенсивности света. Это обстоятельство устраняет известные ограничения при выборе источника света. С другой стороны, как это вытекает из вышесказанного, при росте в виде арифметической прогрессии толщины проходимого слоя раствора, количество проходящего света снижается по геометрической прогрессии. Это означает, что графическое изображение явления будет иметь форму прямой, аналогично таковой, изображающей экспоненциальную функцию.

Однако, на практике, попытка графически представить это явление, отсчитывая на абсциссе концентрацию раствора, а на ординате значения оптической плотности показывает, что в результате соединения получаемых точек не образуется прямая, а кривая, имеющая форму прямой лишь в некоторых участках. Это положение объясняется в первую очередь тем, что окраска раствора связана с реагирующими молекулами, разбавление которых может привести к их изменению за счет электролитической диссоциации, деполимеризации и т. д. Часто все эти факторы могут привести к изменению окраски.

Кроме этого следует учесть, что выражение вполне действительно только для монохроматического излучения. В том случае, когда используемое излучение характеризуется несколькими длинами волн, поглотитель действует как селективный фильтр, изменяя падающий свет, вследствие чего значение а становится постепенно меньшим, по мере того, как значение 1 или с увеличивается. Этот «фильтрующий» эффект зависит от цвета и интенсивности окраски поглотителя, от природы источника света и чувствительности светоприемника. Для того чтобы устранить в большей мере этот эффект, в качестве светоприемника, вместо глаза рекомендуется использование фотоэлемента. Кроме того, рекомендуется разбавление окраски в целях понижения значения с. Однако, как уже было сказано, разбавление поглотителя ведет к его разрушению за счет электролитического разложения, изменения равновесия между различными формами молекул и т.д. Следовательно, предпочитается избегать снижения значения с путем разбавления. Можно снижать значение 1, используя для этой цели кюветы малой длины, содержащие небольшой слой окрашенного раствора.

Все вышеприведенные соображения были учтены при конструировании различных колориметрических приборов. Главное внимание уделялось следующим двум целям: (а) повышению чувствительности светоприемника и (б) получению как можно более гомогенного пучка света.

Что касается чувствительности светоприемника, первый тип прибора - колориметр Дюбоска – основан на зрительном наблюдении.

Схема колориметра Дюбоска приведена на рис. 4. В одну из кювет прибора вводится «контрольный» раствор (окрашенный paстворс известной концентрацией сх, причем в данном случае свет проходит через слой раствора). Во вторую кювету вливают «образец», состоящий из раствора неизвестной концентрации cz. С помощью двух двойных призм, расположенных перед окуляром, оба пучка света, проходящие через кюветы, поступают в окуляр, причем каждый пучок занимает половину зрительного поля. Поднимая или опуская кювету (вторую), содержащую образец, достигается выравнивание интенсивности окраски, что наблюдается в обеих половинах зрительного поля. Для обеспечения равномерности зрительного поля толщина слоя раствора образца, проходимого лучом света отсчитывается на верньере. Зная концентрацию сх контрольного раствора, а также толщины обоих проходимых лучами слоев, можно подсчитать концентрацию анализируемого раствора с помощью формулы.

Рис. 4. Схематическое изображение колориметра типа Дюбоска

В случае колориметра Дюбоска оценка выравнивания зрительного поля производится на глаз. Поэтому, при каждом определении рекомендуется быстро произвести 5–6 отсчетов, которые затем усредняются. Вместе с тем, следует проверить точное расположение верньера на нулевой точке; при этом, первое деление верньера должно находиться перед цифрой «0» градуированной шкалы, когда стеклянные поршни аппарата находятся на дне кювет.

В максимальных условиях работы погрешности определений, производимых с помощью колориметра Дюбоска, не могут быть ниже 2%.

Фотометр Пульфриха (рис. 5) также основан на зрительном наблюдении (V). В этом фотометре наблюдение облегчается использованием дополнительных фильтров (F и F'), благодаря которым можно более правильно оценить интенсивность света на обеих половинах зрительного поля. Кроме того, поскольку оптическая схема прибора является более полной, это дает возможность получить конденсирование световых лучей, проходящих кюветы С и С’ с окрашенными растворами, чем обеспечивается более значительная освещенность поля. Повышение чувствительности условий приема света, а также усовершенствование источника света и механической схемы (отсчет значения осуществляется на градуированных барабанах Т и Т') обеспечивает значительно высокую точность определений по сравнению с результатами, получаемыми на приборе Дюбоска. Используя среднюю от трех последовательных отсчетов, можно достигнуть снижения погрешностей определения до 1%.

Рис. 5. Схематическое изображение фотометра типа Пульфриха. Лучи исходящие из осветительного приспособления проходят через кюветы (С' и С) и подвергаются дифрагмированию в К' и К до выравнивания интенсивности полей зрения, наблюдаемых в окуляре V. Степень диафрагмирования необходимая для этой операции отсчитывается на барабанах Т' и Т, В L и L' лучи конденсируются до Р, где существующая призма вызывает их раздвоение. Фильтрация лучей происходит в F' и F до проникновения в окуляр.

Электрофотометры – это приборы, с помощью которых вопрос чувствительности светоприемника разрешается в оптимальных условиях, т.к. они заменяют зрительное наблючение электрическим (фотоэлементы). На рис. 6 показана схема электрофотометра типа Менье1. В этом приборе оценка интенсивности поглощения света (источник S) осуществляется двумя фотоэлементами Рх и Р2, установленными против гальванометра С. В приборе не применяются кюветы с контрольными растворами, а только кюветы с образцами. Интенсивность окраски (поглощение излучения) оценивается посредством компенсации вдоль траектории левого светового пучка (S – Рх). Этот пучок регулируется с помощью диафрагмы (D) и винта V. Справа (S – Р2) световой пучок, после того как он проходит через щель Р2 (аналогичный с Fj слева), преобразуется в пучок параллельных лучей конденсатором L. Затем он проходит через кювету С с измеряемым раствором и фотометрический клин К.

Рис. 6. Схематическое изображение компенсационного электрофотометра типа Менье

Прибор используется следующим образом: кювету С, заполненную лишь используемым при реакции растворителем («слепой контрольный раствор») ставят на свое место. Призму К устанавливают на нулевой точке градуированной шкалы (что соответствует максимальной абсорбции). Гальванометр С подключается к цепи и с помощью диафрагмы Р и винта V уравновешивают гальванометр.
После этого в кювету С вливают исследуемый раствор, и равновесие гальванометра восстанавливается за счет изменения уровня клина К. Имея в виду, что оптическая плотность клина пропорциональна плотности окрашенного вещества в образце и учитывая, что эта плотность находится в линейной зависимости от перемещения клина К, можно определить концентрацию с анализируемого окрашенного вещества с помощью формул.

Разумеется, электрофотометры также отличаются различными чувствительностями, в зависимости от конструктивной схемы прибора, и, главным образом, в зависимости от используемого типа фотоэлемента. Металл, обеспечивающий получение фотоэлектрического эффекта в применяемом фотоэлементе, отличается определенными характеристиками чувствительности, причем его реакция ограничена определенными длинами волны («красный порог» фотоэлектрического эффекта). Иначе говоря, каждый металл характеризуется определенным минимальным значением энергетических квант, способных вызвать появление электронного потока.

Длины волны, соответствующие этим значениям энергетических квант, называются «красным порогом» фотоэлектрического эффекта для используемого фотоэлемента. Любая длина волны, превышающая этот порог, уже не может воздействовать на элемент, вследствие чего электронный поток и электрический ток не образуются. Значения - красного порога фотоэлектрического эффекта приводятся ниже в ангстремах для различных металлов (по Ляликову):
Платина:    1 962    Литий:    5 260
Никель:    2 463    Натрий:    6 800
Серебро:    2 610    Калий:    10 000
Тантал:    3 050    Цезий:    14 000

Из этих    данных видно, что    следует отдавать предпочтение элементам с цезием, поскольку они обладают чувствительностью к значительному диапазону излучений (наиболее высокий «красный порог»).
Чувствительность фотоэлементов может быть компенсирована или усилена применением источника света с меньшей длиной волны.

Однако, следует отметить, что усилия, приложенные с целью улучшения источника света, используемого в колориметрических приборах, преследовали не только применение излучений с подходящими длинами волны, но и получение монохроматического светового пучка, компонентные излучения которого были бы параллельными.

В этом отношении первый шаг был сделан использованием в фотометрах ламп с шагообразной сеткой (фотометр Пульфриха). В этих условиях испускаемые излучения исходят в виде довольно узкого пучка. Лучи источника света также пропускаются через специальные диафрагмы (К и К' на рис. 5), или расположены параллельно с помощью конденсаторов (L, рис. 6).

Для получения пучка монохроматических излучений используются специальные лампы или селективные цветные светофильтры.

Монохроматические источники света. Излучение, получаемое с помощью лампы накаливания (вольтова дуга), при селективной фильтрации (фильтр Раттен 92) может быть использовано в качестве источника монохроматического света для красного цвета. Излучение D натриевой лампы дает желтый монохроматический свет. Для желтого и фиолетового цвета применяют лампы с ртутными парами, излучение которых фильтруется соответствующими экранами (Раттен 62 и соответственно Раттен 50).

Цветные светофильтры. Комплексное излучение, проходящее через цветной экран, подвергается частичной абсорбции волн, дополнительных к цвету экрана. На этом принципе основано применение цветных светофильтров в колориметрии. Такого рода фильтр должен обеспечить передачу селективного света, совпадающего с наибольшей абсорбцией изучаемого вещества.

Для этой цели необходимо пользоваться источником света, производящим достаточно интенсивные излучения с длиной волны, соответствующей наибольшей абсорбции исследуемого вещества. Вместе с тем для селективной абсорбции необходимо выбрать наиболее подходящий фильтр, который по мере возможности допускает лишь пропускание волны соответствующей длины. Выбор селективного фильтра является весьма важным для успеха определения. Так, например, в то время как использование зеленого светофильтра выявление какого-либо изменения в том или ином гемоглобиновом препарате, в котором оксигемоглобин превращен в восстановленный гемоглобин, в тех же условиях применение красного фильтра весьма ярко выявляет возникающее различие.В главе посвященной методам определения химического состава того или иного биологического препарата для каждого колориметрического метода указаны наиболее подходящие длины волн для проведения измерений. Однако следует отметить, что точный выбор необходимого светофильтра еще не является достаточным для обеспечения правильного результата. Эффективная средняя длина волны зависит не только от фильтра, но и от спектральной чувствительности приемника, и главным образом от «цветной температуры» источника, в основном не уточненной.

Вместе с тем следует учесть, что цветные светофильтры не вполне совершенны. На практике существуют лишь три спектральных области, в которых можно считать, что фильтры могут обеспечить достаточное монохроматическое излучение. Этими областями являются крайний красный цвет (при условии блокировки инфракрасного), зеленый, и в случае необходимости синий. Таким образом нельзя считать целесообразным наличие всей гаммы цветных селективных светофильтров. Так, например, желтый фильтр не может обеспечить селективную передачу желтых излучений, а осуществляет лишь абсорбцию в спектральной области, соответствующей синему и желтому цвету. Существуют также зеленые цвета, обладающие аналогично только абсорбирующим эффектом в красной зоне. В связи с этим положением, поскольку электрофотометры с фотоэлементом обладают значительной чувствительностью в красном спектре, весьма важно использовать методы определения, ведущие к появлению зеленого или синего цвета.

И наконец, следует отметить возможность одновременного применения нескольких фильтров, благодаря чему можно получить предельный ряд селекционированных излучений. Однако, использование интерференциальных фильтров имеет тот недостаток, что вызывает значительную абсорбцию и снижение интенсивности излучения.

Практика колориметрического метода

Методика работы по колориметрии осуществляется в четыре приема:

1. Проведение цветной реакции, специфической для анализируемого материала.
2. Собственно фотоколориметрирование.
3. Построение стандартной кривой.
4. Расчет результатов.

Реакция окрашивания производится соответственно указаниям выбранного метода работы. В принципе, анализируемый препарат подвергается соответствующему экстрагированию, обеспечивающему количественное извлечение дозируемого вещества. После того как это последнее перешло в раствор, в случае необходимости производят удаление элементов, которые могут помешать специфичности реакции. Затем в указанном порядке вводятся реактивы, применяемые с целью получения специфической окраски.
Рекомендуется, чтобы испытания всегда повторялись два или три раза, исходя от равных приготовляемых количеств, половинных или двойных. Эти испытания позволяют выявить возможные анормальные ошибки, возникающие в курсе работы. Вместе с тем, с их помощью можно подсчитать средние результаты.

Кроме того, следует пользоваться «слепыми контрольными образцами», приготовленными таким же образом, как и исследуемые пробы, с тем отличием, что анализируемый препарат заменяется дистиллированной водой. Эти «слепые контрольные образцы» позволяют сделать оценку интенсивности неспецифической абсорбции, вызываемой растворителем и применяемыми реактивами.

Фотоколориметрирование зависит от имеющегося в распоряжении прибора. Способы применения различных наиболее часто применяемых конструкций приборов были изложены выше. Особое внимание следует уделить следующим операциям: регулирование нулевой точки оптического приспособления; выбор соответствующего светофильтра и наладка интенсивности источника света; корректирование аппарата в зависимости от абсорбции «слепого образца».

Построение стандартной кривой. Это – одна из главных операций для осуществления колориметрических методов, от которой в значительной мере зависит точность получаемых результатов.
Для построения стандартной кривой, в ряд реакционных сосудов вводят известные и увеличивающиеся количества чистого вещества, которое подлежит определению в препарате. Затем эти количества обрабатываются также как и образцы и, в конечном итоге, из отсчитанных значений вычитается значение «слепого образца». После этого на миллиметрической бумаге строят стандартную кривую, причем на абсциссе отсчитывают взвешенные количества вещества, а на ординате – цифры, полученные в виде разницы между отсчитанными на образце значениями и значениями отсчитанными на «слепом образце».

При построении стандартной кривой необходимо учесть следующее:

• применяемое для калибровки вещество должно быть химически чистым;
• навески должны начинаться от количества соответствующего половине чувствительности метода, причем увеличение навесок должно быть выбрано надлежащим образом. Пример: предположим, что чувствительность метода 0,0008 мг. В десять реактивных трубок вводятся соответствующие количества;
• используемые количества должны быть точно взвешены;
• цветная реакция на этих контрольных образцах должна проводиться одновременно как с исследуемым, так и со «слепым контрольным образцом».

Как уже было сказано, интенсивность абсорбции падающего света прямо пропорциональна только в известных пределах концентрации абсорбирующего вещества в среде. В результате чрезмерного разбавления образца пропорциональность изменяется, а именно, таким образом, что данные значения контрольных образцов с известными количествами исследуемого вещества уже не будут соответствовать прямой. Общая картина графического изображения проведенных определений будет соответствовать прямой только в известных, относительно ограниченных пределах концентрации вещества. Эта область особенно отчетливо наблюдается вблизи точки чувствительности метода. По этой причине рекомендуется, чтобы исследуемые образцы разбавлялись или концентрировались таким образом, чтобы содержимое количество дозируемого вещества приближалось к пределу чувствительности метода.

Расчет результатов производится учитывая среднее значение отсчитанное Для образца (т), значение «контрольного образца» (п) и исходное количество препарата (в мг). Оценка разницы m-n оценивается на стандартной кривой на соответствующем уровне координаты, а затем на абсциссе – посредством экстраполирования – отсчитывается соответствующее количество (в мг) дозируемого вещества. Если в образце исходное количество препарата р было разбавлено в 20 раз, то

q X 20 х 1000 Р

является количеством (в мг) дозируемого вещества, содержимого в 1 г препарата.