Исследование энзиматической активности трансфераз

Эта группа энзимов катализирует реакции перемещения типа:

R-A + R'-B^R-B + R' - А

В настоящее время известно довольно большое число трансфераз: трансметилазы, трансацилазы, трансгликозидазщ, трансфосфатазы, трансаминазы, трансаденилазы, транссульфатазы, трансформилазы, трансферазы коэнзима А и др.

Эти энзимы играют важную роль во всех клеточных метаболических путях. Так, например, трансглюкозидазы и трансфосфатазы способствуют глюцидному обмену; трансаденозилазы, трансферазы коэнзима А, трансметилазы и трансацилазы принимают участие в энергетическом обмене ацетата и липидов; трансаминазы обеспечивают синтез значительного числа аминокислот и т. д. Трансферазы, благодаря макроэргическим связямметаболитов, превращение которых они катализируют, принимают участие в особо важных процессах, обеспечивающих ряд жизненных функций, как например, рассасывание пищи в кишечнике, почечное выделение и резорбцию, синтез мочевины в печени, ионный обмен на уровне живой клетки, передачу нервного импульса, синтез полисахаридов, белков, коэнзимов и др.

Фосфоглюкомутаза

Она превращает глюкозо-1-фосфат в глюкозо-6-фосфат, причем в конечном итоге равновесие реакции составляет 0,5:9,5 в пользу глюкозо-6- фосфата. Глюкозо-6-дифосфат играет роль коэнзима фосфоглюкомутазы. Ионы Mg++, Мп++ и Со++ активируют реакцию; фториды оказывают инактивирующий эффект.

Интенсивность активности того или иного энзиматического препарата фосфоглюкомутазы можно оценить определяя скорость исчезновения глюкозо-1-фосфата, находящегося в контакте с энзимами1. В основе метода дифференциального определения лежит то обстоятельство, что глюкозо-1- фосфат, подвергаемый действию НС1, при нагревании быстро гидролизуется, в то время как глюкозо-6-фосфат, получаемый в результате действия фосфоглюкомутазы значительно более устойчив в идентичных условиях. На практике, из смеси глюкозо-1-фосфата и энзиматического препарата образцы берут тотчас же после осуществления контакта, а также спустя 5, 10, 15 и 30 минут.

К каждому образцу тотчас же добавляют равный объем концентрированного раствора ацетата бария. В этих условиях имеет место выпадение глюкозо-1, 6-дифосфата (коэнзима) в виде нерастворимой соли бария, затем смесь нейтрализуют при нагреве гидратом бария и фильтруют. Фильтрат промывают горячей водой. Затем к фильтрату и промывочным водам, содержащим гексозомонофосфаты, добавляют НС1, до конечной концентрации этой последней, равной нормальности, и подвергают гидролизу при 100°С в течение 10 минут с орошением.

И, наконец, в гидролизате определяют количество минерального фосфора, выделенного глюкозо-1-фосфатом, не превратившимся до момента удаления образца в глюкозо-6-фосфат.

Перед этим, для повышения чувствительности метода, глюкозо-6-фосфат можно удалить осаждением спиртом (конечная концентрация этанола 50%). Осадок промывают 50-процентным этанолом, а в фильтрате и промывочных водах определяют фосфор глюкозо-1-фосфата.

Неорганический фосфор можно определить, исходя из количества 5 мл раствора, которые вводят в мерную колбу на 10 мл. Добавляют: 2 мл кислого раствора молибдата, 1 мл свежеприготовленного раствора сульфита натрия 20% и 1 мл аскорбиновой кислоты 0,5%. Доводят до метки дистиллированной водой, смешивают и оставляют в покое в течение получаса.

Яркость получаемой синей окраски фотометрируют и сопоставляют с окраской калибровочного образца.

Гексокиназы

Катализируют перевод фосфата с аденозинтрифосфата на гексозы Котельникова; Буланки и Палина.

Гексоз + АТФ гексозо-фосфат -- АДФ + Н+

Определение активности этих энзимов можно произвести:

• либо вышеописанным гидролитическим методом для фосфоглюкомутазы (если конечным продуктом реакции является гексозо-6-фосфат);
• либо манометрическим методом, добавляя к реакционной системе бикарбонатный буферный раствор, выделяющий С02 по мере увеличения количества гексозофосфата. Определение количества выделяемой С02 можно производить с помощью аппарата Варбурга.

Трансаминазы

Трансаминазы – это широко распространенные энзимы, как в животных клетках, так и в растениях и микроорганизмах. Они катализируют перевод аминогрупп с аминокислоты на кетокислоту, обеспечивая образование соответствующей аминокислоты:

• глютаминовая кислота + щавелевоуксусная кислота а-кетоглютаровая кислота + аспартиновая кислота;
• аспартиновая кислота + пировиноградная кислота щавелевоуксусная кислота 4* аланин;
• аланин + а-кетоглютаровая кислота пировиноградная кислота + глютаминовая кислота.

Эти энзимы, открытые советскими авторами Браунштейном и Крицманом, можно легко получить из животных тканей. Так, например, приготовление препарата из глютамико-пировиноградной трансаминазы, обладающего высокой активностью (коэффициент конечной очистки: 50), исходя из сердца свиньи, нуждается в следующих операциях:

• очистка сердца свиньи от жира и соединительной ткани, разрезание мышцы на как можно меньшие кусочки, добавление 4 объемов воды, растирание и фильтрование через стеклянный фильтр;
• к каждым 100 мл фильтрата добавляют 32 г сульфата аммония и после центрифугирования надосадочную жидкость выбрасывают;
• полученный осадок взвешивают в дистиллированной воде, быстро нагревают до 60°С и полученный коагулят удаляют посредством центрифугирования;
• надосадочную жидкость снова осаждают сульфатом аммония (30 г на 100 мл), причем осадок собирают и повторно растворяют в дистиллированной воде. Эту операцию повторяют несколько раз, причем количество использованной для повторного растворения дистиллированной воды сводят до минимума.

Шленк и Фишер2 пользуются следующим методом для приготовления глютамико-щавелево уксусной трансаминазы:

1. Сердце свиньи, очищенное от соединительной ткани и жира разрезают на тонкие кусочки и несколько раз обрабатывают ацетоном до полного обезвоживания. Затем эти Кусочки растирают, а образовавшийся порошок подвергают вытяжке раствором Na2HP04 0,4 м. при 55–60°С.
2. Экстракт доводят до значения pH 4,5, выпавший осадок выбрасывают и затем pH доводят до 7,5.
3. После этого объем раствора удваивают насыщенным раствором сульфата аммония. Выпавший осадок выбрасывают, а к надосадочной жидкости добавляют 1,65 объем насыщенного раствора сульфата аммония. Надосадочную жидкость, получаемую при этом последнем осаждении выбрасывают, а осадок, содержащий энзим снова берут с дистиллированной водой.
4. Раствор доводят до pH 5,8, а затем его адсорбируют на алюминиевом геле. При проведении элюции с хлористым аммонием можно произвести повторную концентрацию энзима.

Определение активности трансаминаз производят в условиях анаэробиоза (вакуум или атмосфера азота), так как молекулярный кислород ингибирует активность.

В качестве субстрата применяют нейтральные растворы исследуемых солей аминокислот и кетокислот, причем окончательная концентрация системы составляет 0,02 м. В сосуд с притертой пробкой вводят определенный объем растворов субстрата, к которым добавляют равный объем буферного фосфатного раствора 0,065 м. при pH 7,8. Смесь нагревают до 38° в течение 10 минут, а тем временем барботируют азот. К концу добавляют энзиматический препарат. По истечение некоторого промежутка времени, в течение которого происходит контакт при 38°С (30 – 60 минут), добавляют 2–Змл H2S04 10% для приостановления реакции.

Затем содержание сосуда количественно переводят в центрифужную пробирку и добавляют 0,25 объема вольфрамата натрия 10%, осаждающего белки. После центрифугирования в надосадочной жидкости определяют количество вновь образовавшейся аминокислоты или разницу аминокислоты, использованной в качестве субстрата и не преобразовавшейся в результате воздействия энзима.

Для определения аминокислот можно применить: либо количественный хроматографический метод, либо – с более точными результатами – специальные методы определения, применяемые для аминокислот.

Ингибиторы трансаминазной активности. В концентрациях 0,001 м хингидрон и п-бензохинон ингибируют до 70–100% активность трансаминаз. В той же концентрации хлорортутный бензоат сокращает на 50% энзиматическую активность. Ариларсины и арсиновые окислы, в 10 раз меньшей концентрации (0,0001 м), ингибируют на 20% активность трансаминаз.

Ион циан в концентрации 0,001 м ингибирует на 30% энзиматическую активность, а при концентрациях в 50 раз больших (0,05 м) – ингибиция увеличивается на 80%.

В случае определения активности глютамико-пировиноградной трансаминазы в большом количестве бакетрий Кутинелли установил, что присутствие в реактивной среде небольших количеств (0,0005 м) цианидов или арсенита повышает скорость реакции. Не отличаются явным действием на трансаминазы следующие вещества: фенилгидразин, гидроксиламин, семи-карбазид (0,002 м), фероцианид, аскорбиновая кислота (0,01 м), глюта- тион (0,05 м), цистеин, сероводород (0,02 м), арсенат натрия (0,02 м) арсенит, селенит, фториды, йодацетат, бромацетат, сульфат железа, метиленовая синь, хлорное железо, толуол, каприловый спирт, этанол (10%), ацетон (15%), нитрат, бикарбонат, ацетат, сульфат, пирофосфат (0,01 м)
а также и ионы С1”, Вг“, 1“*(0,1 м), Мп++ (0,01 м), А1+++ (0,1 м), Na+, К+, NH4+, Mg++ (0,1 м) и РЬ (0,001 м).