Исследование и определение белковых соединений в моче
Нормальная моча не содержит никаких соединений белкового происхождения. Эти последние появляются в моче только в определенных патологических состояниях. Белковые вещества, встречаемые в моче, могут быть разного вида: подлинный белок (естественный), превращенный белок (белковые производные типа альбумоза и пептона), состоящий из неосаждаемых сульфатом аммония полипептидов, ацето- и терморастворимые альбумины и псевдоальбумины (слизистое вещество Мернера).
Реакции исследования и определения альбуминов основаны на их осаждении. В случае небольших количеств альбумина, это осаждение имеет вид облака или весьма слабой мути. Поэтому, необходимо, чтобы моча, в которой анализируется альбумин, была прозрачной. В противном случае ее следует очистить, либо центрифугированием на больших оборотах, либо взбалтыванием с эфиром при наличии жиров, либо фильтрацией после предварительного добавления небольшого количества талька или двуокиси свинца. Добавление этих веществ должно однако производиться осторожно, особенно в случаях, когда моча содержит небольшие количества альбумина, так как они удерживают на фильтре часть этого альбумина.
Если при применении этих методов моча не становится прозрачной, то ее распределяют на две равные части в двух пробирках одинакового диаметра. В одну из этих пробирок добавляют реактив, а другая служит для контроля.
Моча должна давать с лакмусовой бумажкой слабокислую реакцию, иначе ее подкисляют несколькими каплями ледяной уксусной кислоты 10%. И, наконец, если моча содержит весьма малое количество солей, осаждение альбумина затруднительно, в связи с чем рекомендуется добавить несколько капель концентрированного раствора хлористого натрия.
Качественный анализ альбумина
Принцип. Осаждение альбумина минеральными или органическими кислотами в холодном или горячем состоянии в виде нерастворимого кислото-альбумина.
Тест с уксусной кислотой при нагреве
Реактивы:
- Раствор ледяной уксусной кислоты 50%.
- Кислый ацетоуксусный буфер. В мерную колбу на 1000 мл берут 118 г ацетата натрия, добавляют 56,5 мл уксусной кислоты, затем растворяют и дополняют водой до метки.
Техника. В пробирку из иенского стекла берут 10 мл отфильтро ванной мочи держа пробирку в наклонном положении, нагревают таким образом, чтобы начала кипеть только верхняя часть столбика мочи (если подогреть дно пробирки, моча переливается наружу). Затем добавляют 4–5 капель уксусной кислоты 50% (1) или 1 мл кислого ацетоуксусного буфера (2). Если в результате нагревания появляется муть, исчезающая при добавлении уксусной кислоты, то это свидетельствует о том, что моча содержит фосфаты, а если в результате добавления уксусной кислоты имеет место бурное выделение газов, это означает, что в моче имеются карбонаты. Моча содержит альбумин, если муть появляется при нагревании и интенсифицируется в результате добавления уксусной кислоты, или появляется только в этом случае.
Муть, появляющаяся при 58–60°, исчезает при кипячении и снова появляется при охлаждении 58–60°, указывая на присутствие альбумоза. Муть, появляющаяся в холодном состоянии с уксусной кислотой и исчезающая при нагревании, свидетельствует о присутствии псевдоальбумина.
Тест с сульфосалициловой кислотой в холодном состоянии
Реактив. Раствор сульфосалициловой кислоты 20%.
Сохраняют в бутылке коричневого цвета с капельницей.
Техника. Берут два пробирки по 5 мл отфильтрованной и подкисленной мочи (если моча щелочная) с 2–3 каплями ледяной уксусной кислоты 10%. В одну из них добавляют 10–15 капель сульфосалициловой кислоты 20%, встряхивают и исследуют на черном фоне, в то время как вторая пробирка служит для контроля. Если моча остается прозрачной, это означает, что альбумин отсутствует; наличие легкой опалесценции указывает на тонкое облако альбумина. Альбумозы также дают эту реакцию, однако муть, наблюдаемая в их присутствии, исчезает при нагревании в то время, как опалесценция, вызываемая альбумином, увеличивается. Чувствительность этой реакции доходит до 0,15 г альбумина/л. Следовательно, мутность без осадков указывает на присутствие тонкого облака альбумина в то время как наличие более обильного осадка показывает, что альбумин может быть подвергнут определению.
Тест с трихлоруксусной кислотой
К 5 мл отфильтрованной мочи добавляют один кристалл трихлоруксусной кислоты. В присутствии альбумина более сильная муть появляется вокруг кристалла трихлоруксусной кислоты. При нагреве мутность становится более сильной, если она происходит за счет альбумина, или исчезает если ее образует мочевая кислота.
Тест Хеллера с азотной кислотой
В пробирку берут 2 мл концентрированной азотной кислоты (уд. вес =1,40) и с помощью пипетки Пастера на внутренние стенки осторожно сливают 2 мл отфильтрованной мочи таким образом, чтобы жидкости не смешались. Если на границе раздела между этими двумя слоями появляется белое кольцо, это свидетельствует о присутствии альбумина в моче. Если мутное кольцо появляется над границей раздела, его присутствие обязано псевдоальбумину (слизистое вещество Мернера). Это кольцо растворяется встряхиванием, благодаря растворимости избытка этого вещества в кислоте. Само собой разумеется, что если образуются два кольца, а именно, одно на границе раздела, а другое – выше, то в данном случае можно говорить о совместном присутствии альбумина и псевдоальбумина (муцина). Если моча содержит также желчные пигменты, появляются одновременно различные окрашенные кольца. Чувствительность реакции доходит до 0,02 г альбумина/л.
Тест Танре
Реактив. Отвешивают 3,32 г йодного калия и 1,32 г хлорной ртути, добавляют 20 мл ледяной уксусной кислоты и затем растворяют в 60 мл дистиллированной воды.
Техника. Берут 5 мл отфильтрованной мочи и добавляют по каплям реактив Танре. В присутствии альбумина, псевдоальбумина или пептонов, появляется муть или осадок, которые при нагреве снова растворяются, если они связаны только с наличием муцина или пептона.
Тест Эсбаха
Реактив Эсбаха: смешивают 10 г пикриновой кислоты с 20 г кристаллической лимонной кислоты, затем растворяют при нагреве в 1000 мл дистиллированной воды; после охлаждения фильтруют.
Техника. К 2–3 мл отфильтрованной мочи добавляют 2–3 капли реактива Эсбаха, который помимо альбумина осаждает также альбумозы, пептоны, слизистые вещества, мочевую кислоту, креатинин и алкалоиды. Образуемый алкалоидами осадок исчезает при нагревании и снова появляется при охлаждении, а осадок, вызываемый альбумином становится более обильным при нагревании.
Примечание. Чувствительность качественных реакций снижается в следующем порядке: сульфосалициловая кислота, реактив Танре, трихлор- уксусная кислота, уксусная кислота, реакция Хеллера – менее рекомендуемая, и наконец, реакция Эсбаха, используемая, главным образом, для определения альбумина.
Реакции дифференцирования белковых веществ
Псевдоальбумин (слизистое вещество Мернера).
Реактив Лекорше-Таламова: растворяют 100 г лимонной кислоты в 75 мл дистиллированной воды.
Техника. Берут 3 мл мочи и с помощью пипетки Пастера конец которой доводят до конца пробирки, добавляют 2–3 мл сиропообразного раствора лимонной кислоты, а именно таким образом, чтобы жидкости не смешивались между собой. На границе раздела между обеими жидкостями в присутствии слизистых веществ спустя 1–2 минуты появляется белое кольцо. Альбумин не осаждается этим реактивом.
Примечание. Реакция характеризуется чувствительностью и может производиться одновременно с реакцией Хеллера (см. выше). В этом случае существуют три возможности:
а) если моча содержит только альбумин, лимонная кислота не дает никакого осадка, в то время, как в пробирке с азотной кислотой на границе раздела жидкостей появляется белое кольцо;
б) если моча содержит только псевдоальбумин, то белое кольцо появляется в образце с лимонной кислотой на границе раздела жидкостей, в то время как в образце с азотной кислотой оно появляется выше этого предела;
в) и наконец, если моча содержит и альбумин и псевдоальбумин, то в образце с лимонной кислотой на уровне раздела между жидкостями наблюдается появление кольца, в то время как в образце с азотной кислотой видны два кольца: одно на границе раздела и другой – выше этой границы. В этом случае разделение упомянутых двух форм альбумина производят следующим образом: к 20 мл мочи осторожно по каплям добавляют уксусную кислоту 10%, до тех пор, пока объем осадка не перестанет увеличиваться, и затем фильтруют. Подлинный альбумин переходит в фильтрат вместе с альбумозами и пептонами, в то время как псевдоальбумин остается на фильтре. К 10 мл фильтрата добавляют 2–3 г кристаллического, тонко размельченного сульфата натрия, центрифугируют, нагревают и добавляют 2-3 капли (не больше 10) уксусной кислоты 10%. В присутствии подлинного альбумина появляется муть и осадок, который отделяют от альбумозов и пептонов фильтрацией. Реакция отличается исключительно высокой чувствительностью.
Альбумозы. К 2 мл вышеупомянутого фильтрата добавляют по каплям реактив Танре, Эсбаха или трихлоруксусную кислоту 20%. В присутствии альбумозов появляется осадок, исчезающий при нагревании, и вновь появляющийся при охлаждении.
Примечание. Эту реакцию дают также и алкалоиды (хинин и др.).
Пептоны нейтрализуют 5 мл вышеуказанного фильтрата (индикатор фенолфталеин 1%), нагревают до 30° и добавляют 1–2 г кристаллического тонко растертого сульфата натрия, осаждающего альбумозы, таким образом, что при фильтрации эти последние остаются на фильтре, а пептоны переходят в фильтрат и выявляются посредством нингидриновой реакции добавляют несколько капель раствора нингидрина 1%и нагревают 5 МИНУТ до кипения. В присутствии пептонов появляется синяя окраска.
Другой реакцией идентификации является реакция бюрета: фильтрах хорошо подщелачивают, затем добавляют по каплям раствор сульфата меди 1%, встряхивая после каждой капли. В присутствии пептонов появляется фиолетовая окраска, постепенно переходящая в синюю.
Примечание. Реакцию бюрета дают также уробилиноген и гистидин.
Различие между «альбумозами и пептонами» является в значительной мере условным, так что оно не имеет какой либо ценности для точной классификации этих групп.
Терморастворимый альбумин (Бенс–Джонс). Отфильтрованная моча, содержащая альбумин Бене-Джонс, дает муть или осадок при нагреве до 60° в водяной бане. Эта муть исчезает при повышении температуры нагрева. Альбумин Бенс-Джонса коагулируется, если в мочу добавляют соляной кислоты 12,5%.
Уксуснорастворимый альбумин. К 18 мл отфильтрованной мочи добавляют 2 мл хлористого натрия 2%, затем нагревают. В присутствии уксуснорастворимого альбумина появляется осадок, исчезающий при добавлении 1–2 капель (или более) ледяной уксусной кислоты.
Определение альбумина
Метод Эсбаха
Применяют реактив Эсбаха, которым пользуются также при качественном анализе, и альбуминометр Эсбаха, состоящий из стеклянной трубки, на которой в верхней части имеется метка R, а посредине метка U (рис. 43). В нижней части трубка отградуирована от 1/2 до 12.
Рис. 43. Альбуминометр Эсбаха.
Техника. Трубку Эсбаха наполняют отфильтрованной мочой до метки U, затем добавляют реактив до метки R. Хорошо встряхивают и затем оставляют в покое в вертикальном положении до следующего дня, для того, чтобы альбумин мог осесть. Высоту осажденного слоя отсчитывают непосредственно в г/л альбумина.
Примечание. Если нагревать постепенно в водяной бане в течение 5 минут при 70°, то отложения осадка происходят гораздо быстрее, так что результат можно получить по истечении одного часа. Щелочная моча предварительно подкисляется 2–3 каплями ледяной уксусной кислоты и, если она содержит значительные количества альбумина, ее разбавляют дистиллированной водой 1/1, если удельный вес ниже 1 020, и 1/2 – если удельный вес выше 1 020. Полученный результат умножают на кратность разбавления.
Метод Хеллера
Метод тот же, что и для определения альбумина в спинномозговой жидкости. Этот метод следует применять всегда, когда количество содержимого в моче альбумина менее 1 г/л, так как ниже этого значения показания альбуминометра Эсбаха неправильны.
Гравиметрический метод
Принцип. Количественное осаждение альбуминов трихлоруксусной кислотой.
Техника. В зависимости от количества альбумина, содержащегося в образце берут 10, 20или 50 мл отфильтрованной мочи; объем дополняется до 100 мл изотоническим раствором NaCl, добавляют 8 мл трихлоруксусной кислоты 30% и затем погружают на 10 минут в кипящую водяную баню, от времени до времени помешивая. Оставляют в покое на 30 минут, после чего фильтруют через двойной фильтр, промывают горячей дистиллированной водой, высушивают в сушильном шкафу при 105–110° до постоянного веса и взвешивают. Разница в весе между обоими фильтрами дает вес присутствующего во взятом образце альбумина.
Расчет на 50 мл мочи: Альбумин г/л = Р х 20, где: Р – вес осадка в граммах.
Примечание. Трихлоруксусная кислота осаждает все белковые вещества, за исключением пептонов.
Физиопатологические изменения. Альбуминурия может быть пищевого происхождения (яичный альбумин, куриное мясо) или может возникнуть после физического усилия или расстройств кровообращения, вызванных холодными ваннами, при некоторых заболеваниях нервной системы (поражение сосудов, менингиты и др.). Почечная гематурия может быть причиной альбуминурии (кровяной альбумин). Наиболее существенные альбуминурии вызываются рядом почечных заболеваний, нефрозом, амилоидным перерождением почки, гломерулонефритом и др.
И наконец, альбуминурии могут встречаться при некоторых инфекционных болезнях: пневмонии, скарлатине, рожистом воспалении и др.
Альбумин Бенс-Джонса появляется при остеосаркомах, множественных миэломах, лимфатической лейкемии и др. Альбумозы встречаются, главным образом, при эмпиеме, долевой пневмонии, а также при следующих инфекционных болезнях: скарлатине, гриппе, дифтерии, брюшном тифе, краснухе и легочном туберкулезе.
