Хроматографический анализ глюцидов и протидных веществ

Хроматографический анализ глюцидов

В «этих случаях в качестве растворителей можно пользоваться следующими смесями:

• н-бутанол 4 части + уксусная кислота 1 часть + вода 5 частей;
• н-бутанол 4,5 частей 4- этанол 0,5 частей + вода 4,9 частей + аммиак 0, 10 части;
• этилацетат 2 части + пиридин 1 часть + вода 2 части;
• насыщенный водой коллидин;
• фенол насыщенный 1% аммиачной водой.

Для ориентировки в таблице XXII приводятся значения rf различных сахаров, в зависимости от используемого растворителя.

Хроматографическое проявление глюцидов производится с помощью реактивов окрашивающих восстановительные группы. Помимо этого, могут быть использованы также реактивы, вызывающие в кислой среде образование фурфурола или других реакций, специфических для химической структуры молекулы (см. часть III).

Поскольку полиозиды имеют только незначительное число восстановительных группировок, их нельзя непосредственно определить хроматографическим путем, а только после предварительного гидролиза. Этот последний производиться предпочительно в H2S04 2н в течение 4 часов с орошением. Последующая нейтрализация проводится с Ва (ОН)2, причем образующийся осадок BaS04 удаляется фильтрованием.

Глюкозиды типа флавонозидов и антоцианозидов удалось хроматографировать, использовав в качестве подвижной фазы смесь состоящую из: н-бутанола 4 части + уксусной кислоты 1 часть + воды 5 частей или смесь: метакрезол 5 частей + уксусная кислота 0,2 части + вода 4,8 частей. Пятна могут быть получены проявлением хлорным железом или еще лучше – реакцией с аммиачным азотнокислым серебром (см. ниже). Впрочем, эти соединения обладают как таковые естественной окраской, что дает возможность непосредственно наблюдать за появлением пятен.

Общие проявители глюцидов. Благодаря наличию восстановительных группировок, глюцидные вещества вызывают темно-коричневую окраску аммиачного азотнокислого серебра. Партридж применяет для опрыскивания хроматограммы смесь приготавливаемую непосредственно перед использованием, состоящую из одинаковых объемов AgNOg 0,1 н. и NH3OH 5 н. Хроматограмма высушивается в сушильном шкафу в течение 10 минут.

Метод с аммиачным азотнокислым серебром отличается тем недостатком, что дает аналогичную реакцию с фенолами.

Другой более чувствительный метод применяет в качестве проявителя смесь приготовляемую непосредственно перед использованием, состоящую из 3 частей раствора А и 1 части раствора Б.

Раствор А: 1 г моноанилидафталовой кислоты, растворенного в 150 мл 96% этанола.

Раствор Б: 0,5 г 4,4-диаминодифенила (бензидина) растворенных в 80 мл 96% этанола и 20 мл ледяной уксусной кислоты.

После опрыскивания сушка производится в течение 20 минут при 105°С. С помощью этого проявителя гексозы дают бурые пятна, пентозы – фиолетовые пятна, а метилпентозы – зеленовато-желтые пятна.
Кроме того, в качестве проявителя можно использовать также другой раствор моноанилида фталовой кислоты, приготовляемый непосредственно перед применением, растворяя 3,3 г фталовой кислоты и 2 мл аналина в 95 мл ацетона и 5 мл дистиллированной воды. Получаемые пятна имеют красно-фиолетовый цвет.

Проявители альдоз. Оксалат анилина (приготовленный непосредственно перед употреблением из щавелевой кислоты и анилина, растворенных в ацетоне или насыщенном водой бутаноле) дает цветные реакции с альдогексозами, альдопентозами и метилальдопентозами. Опрысканная хроматограмма должна высушиваться в горячем воздухе (80°С).

Для этой цели используются также: метафенилендиамин, уксусный бензидин, р-нафтиламин и др.
Проявители цетоз, Нафторезорцинол или резорцинол в кислой (трихлоруксусной, солянокислой, фосфорной) среде дает дифференцированные цветные реакции с уроновыми кислотами, пентозами, метилпентозами и цетогексозами. Проявитель приготовляется смешивая непосредственно перед употреблением одинаковые объемы 0,2% раствора нафто- резорцинола в 96% спирте, с 2% раствором трихлоруксусной кислоты. После опрыскивания хроматограмма высушивается при 105°С.

Хроматографическое микроопределение глюцидов. Имея ввиду, что хроматография на бумаге дает возможность анализировать образцы содержащие весьма малые количества сахаров (20–40 микрограммов) и учитывая, что с ее помощью можно разделить сахары, для которых пока еще не существуют специфические химические методы определения, в настоящее время она является наиболее целесообразным способом количественного анализа глюцидных препаратов.

Для микроопределения глюцидов хроматографическим способом, предложенным Валленфельсом Ш применяют в качестве растворителя следующую смесь: н-бутанол 4 части + ледяная уксусная кислота 1 часть + вода 5 частей. После орошения, хроматограмма тщательно высушивается и затем пропитывается смесью, приготовленной непосредственно перед употреблением из равных частей 2% водного раствора хлористого трифенил- тетразола и NaOH н. Пропитанную хроматогамму оставляют на 20 мин при температуре 40°С в водонасыщенной атмосфере, после чего ее переводят в ванночку с дистиллированной водой для удаления избыточного хлористого трифенилтетразола, и затем высушивают при 25°С. Одновременно с высушиванием появляются пятна окрашенные в красный цвет, причем интенсивность окраски пропорциональна концентрации соответствующего сахара. Быстрым методом определения является оценка интенсивности окраски по сравнению с эталонами, содержащими известные количества сахара, обрабатываемыми аналогичным образом. Все же, эта оценка не отличается достаточной точностью. Поэтому предпочитается вырезывание пятен и экстрагирование окраски с помощью смеси пиридина и 10% НС1. Если экстрагирование проводится и в случае эталонных образцов, после выравнивания экстрагированных объемов можно приступить к колориметрированию растворов, сравнивая их с контрольными образцами. Однако, и в этом случае погрешности результатов составляют не менее 10%.

Следует отметить, что метод микродозировки глюцидов хроматографическим способом можно упростить (Дюбуа, 1950), используя в качестве реактива серный фенол. Для достижения наибольшей точности рекомендуется использование в качестве растворителя смеси уксусной кислоты с этилацетатом. Когда для орошения используются пиридин или бутанол, до обработки фенолом для удаления растворителя необходимо произвести несколько повторных промываний. Промывания производятся в кювете с безводным эфиром, с последующим выпариванием в вакууме.

В этом случае, принимая во внимание, что сахары не проявлены необходимо нанести каждый образец на фильтровальную бумагу в двух экземплярах, а затем, после орошения, вырезать одного из образцов, проявить его и затем на непроявленном образце идентифицировать уровень пятен. После идентифицирования их вырезывают и затем каждый образец подвергается элюции в дистиллированной воде при температуре лаборатории. В этих условиях в течение 15 минут, при частом встряхивании сахар количественно растворяется в воде.

После этого элюционная вода концентрируется на водяной бане (100 °) до 5 мл объема, из которого 3 мл берут для определения. Однако, если количество сахара в элюате достаточно велико, элюат фильтруется, а из фильтрата берут 3 мл для определения.

К этим 3 мл элюата (концентрированного или нет) добавляют: 0,05 мл 80% раствора очищенного (дистилляцией) фенола и 5 мл концентрированной H2S04 для анализа (без мышьяка). Спустя 15 минут производится фотоколориметрирование (синий фильтр X = 4820 А). Стандартная кривая строится с помощью небольших количеств дозируемого сахара, приводимых в контакт непосредственно с сернофеноловым реактивом. Для большей предосторожности контрольный образец может быть наложен на хроматограмму, вырезан и элюирован параллельно этой последней, после чего производится: фотоколориметрирование в одинаковых условиях.

Хроматографический анализ протидных веществ

Среди протидных веществ только аминокислоты и полипептиды могут быть дифференцированы при помощи хроматографического анализа. Белковые макромолекулы должны быть предварительно подвергнуты гидролизу освобождающему составные аминокислоты. Впрочем, отсутствие подходящих контрольных образцов заставляет таким же образом поступать с полипептидами. Гидролиз осуществляется с орошением в течение 8 часов, причем препарат растворяется в НС1 конечной концентрации 6 н. После гидролиза, раствор нейтрализуется, причем в большинстве случаев необходимо произвести концентрирование гидролизата (на водяной бане при 100 °С или в вакууме).

Однако, концентрирование вызывает массивный рост концентрации солей, что по-видимому препятствует получению удовлетворительных результатов при хроматографировании. По этой причине до хроматографирования из концентрированного гидролизата необходимо удалить соли. Для этой цели можно использовать электродиализ или фильтрование через ионообменные смолы. В случае аминокислот используются катионовые смолы (Пермутит 50; Дуолит 6–3; Довёкс SO, Зео-Карб 215). Эти вещества препятствуют прохождению аминокислот в виде катионов и пропускают минеральные анионы, глюциды и в неионизированные вещества. Если впоследствии колонка со смолой обрабатывается аммиачной водой, эта последняя количественно увлекает за собой аминокислоты (превратившиеся в анионы) и оставляет адсорбированные катионы.

Во избежание образования солей, после гидролиза соляная кислота может быть непосредственно удалена, с помощью повторной выпарки в вакууме, пока не останется только количество кислоты связанное в виде хлоргидрата аминокислот. Удаление используемой при гидролизе соляной кислоты можно осуществить также повторной обработкой гидролизата хлороформным раствором диэтилгексиламина. В контакте с соляной кислотой это вещество образует хлоргидрат, растворимый в хлороформе и, следовательно, увлекаемый этим последним.

В случаях, в которых подвергаемый гидролизу препарат является трихлоруксусным экстрактом, во время его нагревания в присутствии НС1 образуется хлороформ. До хроматографирования, хлороформ следует удалить слегка подогревая, свыше 25°С.

Растворители обычно применяемые в практике хроматографического анализа аминокислот, следующие:

• н-бутиловый спирт насыщенный водой (предпочтительно в момент приготовления смеси, добавляются несколько капель аммиака);
• н-бутиловый спирт 4 части + ледяная уксусная кислота 1 часть + вода 5 частей;
• бензиловый спирт, насыщенный водой (при проведении насыщения добавляется 1°/00 цианистого натрия);
• смесь состоящая из: 1 объема коллидина, 1 объема лютидина разбавленного 1/2 и 2 объемов воды;
• при приготовлении смеси добавляют 5 капель диэтиламина;
• фенол насыщенный водой, в присутствии 1 °/00 аммиака.

Ориентировочно, в таблице XXIII даются значения rf различных аминокислот в зависимости от применяемого растворителя.

Классическим проявителем аминокислот на хроматограмме является нингидрин (гидрат трицетогидридена). Обычно опрыскиваемый раствор приготовляется в 0,1 – 0,2% концентрации в н-бутаноле.

В качестве растворителя можно пользоваться также 96% спиртом. Когда подвижная фаза содержит аммиак, рекомендуется добавлять 1% ледяной уксусной кислоты, чем достигается хорошая нейтрализация слишком щелочных зон. После опрыскивания нингидрином хроматограмма высушивается при 105°С.

Нингидрин проявляет (синие-фиолетовые пятна) все аминокислоты (а, р>, у, 8, е), а также первичные амины. Пролин и гидроксипролин, а также триптофан дают бледножелтые пятна. Для этих аминокислот рекомендуются специальные проявители.

Проявление пролина и гидроксипролина можно произвести с помощью реактива с уксусным изатином, приготовленным посредством растворения 0,2 г изатина в 96 мл н-бутанола и 4 мл ледяной уксусной кислоты. Пролин дает синие, ярко окрашенные пятна на желтом фоне. Гидроксипролин дает такую же, но бледную окраску.

Тирозин и гистидин дают желтые пятна и, соответственно, розовые с диазосульфаниловой кислотой. Кислоту необходимо приготовить свежей, а именно следующим способом: к 1 объему 1 % салициловой кислоты в НС1 н. добавляют 1 объем 5% водного раствора NaN02; оставляют в покое примерно 5 минут и затем добавляют (твердого) NaHC03, пока выделение газа не прекращается (а щелочность раствора отражается наличием желтоватой окраски).

Феноловые аминокислоты (фенилаланин, тирозин, триптофан) могут быть проявлены реактивом Фолин-Чокылтэу.

Триптофан проявляется реактивом Эрлиха (0,5 п-диметил- аминобензальдегида растворенных в 99 мл 96% спирта и 1 мл концентрированной НС1. После опрыскивания хроматограмма высушивается в сушильном шкафу и оставляется на 2–4 часа в атмосфере паров НС1. В этих условиях триптофан дает синие пятна.

Для специфического проявления других аминокислот могут быть использованы специальные реактивы (см. часть III).

Хроматографическое микроопределение аминокислот. Так же, как и в случае глюцидов, аминокислоты можно разделить хроматографически. Пятна вырезываются, краситель элюируется, а яркость окраски оценивается в сопоставлении с контрольным образцом известной концентрации.

Наряду с этим можно применить метод параллельных образцов и3 которых один проявляется и применяется для идентификации пятен в непроявленном образце. После идентификации пятна вырезываются и элюируются водой (слабо аммиачной). На элюатах колориметрически определяются присутствующие аминокислоты с использованием специфических реактивов (см. часть III).

Для определения аминокислот можно прибегнуть к их разделению при помощи хроматографии на колонке. Так, например, колонка солянокислого силикагеля абсорбирует гексоновые основания из различных препаратов. Солянокислый алюминий удерживает дикарбоновые аминокислоты. Пропускание препарата через колонку активированного угля вызывает в присутствии уксусной кислоты задержание триптофана, тирозина и фенилаланина. Нейтральные производные неароматических аминокислот не удерживаются ни одной из вышеупомянутых колонок, а остаются в фильтрате препарата. На фильтрате, а также на элюциях абсорбционных колонок, посредством специфических методов можно определять (см. часть III), аминокислоты присутствующие в раздельных группах, применяя вышеописанный способ.