Методы приготовления ряда биологических компонентов

В течение биохимических исследований возникает довольно часто необходимость приготовить определенные биологические продукты для проведения предпринятых опытов. Поэтому считаем целесообразным привести ниже несколько методов приготовления ряда биологических компонентов. С другой стороны, поскольку для описания были выбраны методы отделения и очистки как для белков и нуклеопротеинов, так и для липидов и полисахаридов, описанные методы являются примерами, которые могут указать технику применения аналогичных способов приготовления и других компонентов, не приводимых в настоящей главе.

Очистка овоглобулинов

Яичный белок (свежий) растворяют 1:5 в дистиллированной воде. Затем объем раствора удваивают насыщенным раствором сульфата аммония (50,8%), получая таким образом насыщенный сульфат аммония. Образуется осадок, состоящий из овоглобулинов. Этот осадок центрифугируют, растворяют в воде и снова осаждают полунасыщенным сульфатом аммония, – операция, обеспечивающая очистку.

Часть овоглобулина состоит из лизоцима, полипептид с бактериологическим действием на грам-положительные микробы.

Кристаллизация лизоцима

Яичный белок гомогенизируют и доводят до pH 9,5. Затем добавляют хлористый натрий для того, чтобы получить окончательную концентрацию 5%. Смесь выдерживают при + 4°С после предварительного введения нескольких кристаллов лизоцима для обеспечения кристаллизации.

Если подобные кристаллы отсутствуют, препарат сохраняют при + 4°С в течение 2 недель, причем за весь этот промежуток времени 2–3 раза в день внутренние стенки сосуда натирают стеклянной палочкой. По истечение этого времени мазок, приготовленный с центрифугатом смеси указывает на образование нескольких кристаллов лизоцима. Эти последние можно использовать для вышеуказанной кристаллизации.

Образовавшиеся кристаллы собирают центрифугированием и растворяют в небольшом объеме разбавленной уксусной кислоты (pH 4–6). Нерастворимый материал удаляют. Затем, доведя pH до 9,5–10 и добавляя хлористый натрий 5%, вызывают перекристаллизацию лизоцима. Целью повторных кристаллизаций является получение как можно более чистого продукта.

Кристаллизацию можно осуществлять также в присутствии бикарбоната натрия 5% при pH 8–8,5.

Кристаллизация овальбумина

После осаждения овоглобулинов сульфатом аммония (смотри выше), раствор белка куриного яйца фильтруют, после чего к фильтрату добавляют порциями такое количество насыщенного раствора сульфата аммония, пока раствор не приобретает устойчивое помутнение. В этот момент берут отдельно десятую часть объема раствора и с помощью бюретки к нему добавляют серную кислоту 0,2 н., непрерывно взбалтывая. Можно заметить, что первые порции серной кислоты угнетают помутнение раствора.

Впоследствии, добавление серной кислоты ведет к образованию тонкого осадка, растворившегося вначале при взбалтывании, а затем дающего интенсивную и устойчивую опалесценцию. Отсчитывают количество H2S04 0,2 н, добавленной для образования этой опалесценции и в необработанный раствор (9/10 из объема), приливают 9-кратное количество, непрерывно встряхивая.

Полученный таким образом мутный раствор оставляют при комнатной температуре. По истечении 1–3 часов начинают появляться первые кристаллы овальбумина, причем кристаллизация полностью завершается в течение 2–5 дней.

Образовавшиеся кристаллы собирают центрифугированием и растворяют в дистиллированной воде. Затем кристаллизацию повторяют. Для того чтобы получить чистый овальбумин (без овомуцина и кональбумина) необходимы 3–6 подобных перекристаллизаций.

Получаемые кристаллы должны сохраняться в сосуде в холодном месте (+ 4°С), покрытыми надосадочной жидкостью последней кристаллизации. Для использования соответствующего количества кристаллов, их растворяют в воде и подвергают диализу (24 часа) для удаления присутствующих солей.

Кристаллизация сывороточного альбумина

К одному объему лошадиной сыворотки добавляют равный объем насыщенного объема сульфата аммония. Осажденные таким образом глобулины удаляют повторным фильтрованием. К прозрачному фильтрату с помощью бюретки добавляют по каплям H2S04H., до образования устойчивого помутнения. Измеряют количество использованной серной кислоты и затем к раствору приливают равное количество насыщенного раствора сульфата аммония. В результате этой операции на мазке, приготовленном с центрифугатом мутного раствора, под микроскопом должны наблюдаться несколько небольших кристаллов. В случае если наблюдается только аморфное вещество, раствор просветляют добавлением аммиака и затещ тщательно повторяют операцию помутнения, контролируя, чтобы значение pH никогда не снижалось менее 4,8 или 4,7.

Кристаллизация завершается при комнатной температуре. Спустя 1–2 дня наблюдается образование обильного осадка зеленоватых кристаллов (надосадочная жидкость остается мутной, но бесцветной). Осадок собирают центрифугированием и растворяют в объеме холодной воды (- 4°С) в 5 раз меньшем по сравнению с исходным. Растворение можно ускорить добавлением аммиака (количество, которое не должно увеличивать значение pH выше 5,0). Полное растворение проверяют под микроскопом с помощь» мазков (аморфное вещество). Проверка невооруженным глазом не представляется возможной, так как раствор остается мутным. Затем препарат фильтруют, доводят аммиаком до значения pH 7,0, добавляют равный объем концентрированного сульфата аммония и, по истечении 24 часов при комнатной температуре фильтруют (удаляя выпавшие глобогликоиды). Фильтрат, еще мутный, осторожно подкисляют (pH 4,8) и снова оставляют для медленной кристаллизации. Перед употреблением образовавшиеся кристаллы снова растворяют в холодной воде и диализируют (Черныков).

Кристаллизация гемоглобина

Известное количество лошадиных (или собачьих) красных кровяных шариков несколько раз промывают изотоническим соляным раствором, затем кровяные шарики растворяют с помощью дистиллированной воды (к которой добавляют 5–10% эфира); центрифугируют. Надосадочную жидкость оставляют на ночь при +4°С, затем добавляют равный объем насыщенного сульфата аммония и тотчас же удаляют образовавшийся осадок (глобулины). Фильтрат оставляют на ночь при + 4°С, а на следующий день образовавшиеся кристаллы оксигемоглобина собирают фильтрованием на воронке Бюхнера или медленным центрифугированием.

Кристаллизация гемина

Достаточное количество лошадиных красных кровяных шариков (40 мл), несколько раз промытых изотоническим раствором NaCl, разбавляют равным объемом воды и центрифугируют.

В колбу Эрленмейера вводят 100 мл ледяной уксусной кислоты и 0,5 г NaCl. Смесь нагревают до кипения и затем встряхивая вливают по каплям надосадочную жидкость кровяных шариков. Кипячение продолжают в течение 5 минут и затем раствор постепенно охлаждают, сначала при комнатной температуре, а после этого в холодильнике. Оставляют на ночь в лаборатории, затем сливают надосадочную жидкость. Выпавшие кристаллы берут с уксусной кислотой 10%, промывают водой, спиртом и эфиром, затем сушат в вакууме.

Таким образом полученный гемин является очищенным, не нуждаясь в повторной рекристаллизации.
Перед использованием кристаллы гемина растворяют в щелочном растворе с pH 9.

Кристаллизация технического пепсина

Около 500 г технического пепсина растворяют в поллитре дистиллированной воды. Добавляют 500 мл H2S04 н. и 1000 мл насыщенного раствора сульфата магния (99,4% MgS04.7 Н20).

Образовавшийся осадок собирают фильтрованием на воронку Бюхнера и дважды промывают раствором 2/3 насыщения сульфата магния. Затем берут количество воды, достаточное для образования мягкой кашицы и добавляют NaOH 0,5 н. до полного растворения (значение pH не должно превышать 5,0). Затем снова осаждают H2S04 0,5 н. (pH 3); оставляют на 3–6 часов при + 8°С, затем фильтруют.

Этот третий осадок вводят в цилиндр вместе с небольшим количеством теплой воды (45°С) и растворяют NaOH 0,5 н. (смотри выше). Если раствор мутный, его фильтруют. Затем цилиндр погружают в сосуд с водой при 45°С и оставляют для медленного охлаждения при комнатной температуре, благодаря чему образуется кристаллический осадок. Этот осадок снова берут H2S04 0,5 н, (pH 3), что ведет к образованию аморфного осадка, тождественного с вышеупомянутым (третий осадок). Осадок снова берут с теплой водой, растворяют в NaOH 0,5 н. до значения pH 5, после чего раствор после фильтрования кристаллизуют, как было указано выше.

Приготовление нуклеиновых кислот

Метод Тсубои и Стоуэл

Препарат, из которого делают вытяжку (тимус, печень) растирают в холодном состоянии с кварцевым песком, в присутствии 4 объемов NaCl 0,14 м. Гомогенат центрифугируют в течение 4 минут при 6.000 об/мин. Полученный осадок содержит все количество дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК), присутствующей в препарате, в то время как надосадочная жидкость содержит наибольшую часть рибонуклеиновой кислоты (РНК).

Для получения ДНК центрифугат подвергают механическому титрованию (Waring blendor) и 2–3–кратной вытяжке в холодном состоянии насыщенным раствором NaCl. Экстракт центрифугируют, а белковый осадок удаляют. К надосадочной жидкости добавляют 2 объема спирта, а образовавшийся волокнистый осадок ДНК очищают промыванием и взбалтыванием с хлороформом. Производительность метода 45% общего ДНК, присутствующего в исходном препарате.

Для получения РНК надосадочную жидкость исходного препарата экстрагируют при нагревании раствором NaCl 10%. Затем экстракт просветляют фильтрованием. К фильтрату добавляют 2 объема спирта. Образуется осадок РНК, который очищают встряхиванием с хлороформом. Производительность метода: 40% общей РНК, присутствующей в исходном препарате.

Метод Мирский-Поллистера для приготовления ДНК

Материал (селезенка, тимус, почки), извлекают путем растирания в присутствии одного объема льда в порошке и двух объемов NaOH 0,14 м. (к которым добавляют цитрат натрия 0,01 м. для торможения эффекта дезоксирибонуклеазы). Экстракт фильтруют и центрифугируют в течение одного часа при 12 000 об/мин. и + 4°С. Осадок снова подвергают экстрагированию в тех же условиях, затем взвешивают в молярном растворе хлористого натрия. Это ведет к растворению дезоксирибонуклеопротеинов, вследствие чего вязкость препаратов увеличивается. Энергично встряхивают в течение 5–10 минут, затем раствор просветляют центрифугированием при 12 000 об/мин. Надосадочную жидкость вливают в 6 объемов воды вследствие чего дезоксирибонуклеопротеины выпадают в виде волокон. Осадок можно собрать на стеклянную палочку, затем его снова растворяют BNaCl, центрифугируют, а надосадочную жидкость подвергают повторному осаждению 6 объемами воды. После еще 1–2 повторных осаждений, дезоксирибонуклеопротеины растворяют в слабом щелочном растворе (pH 9) и к 3 объемам этого раствора добавляют 1 объем смеси, состоящей из 4 частей хлороформа и 1 части октиловой кислоты. Смесь энергично встряхивают в продолжение 10 минут, а образовавшийся хлороформопротеиновый гель удаляют центрифугированием. Операцию очистки хлороформом повторяют. Конечную надосадочную жидкость, содержащую чистую и высокополимеризованную ДНК вливают в 3 объема спирта. Осадок ДНК затем промывают спиртом (для удаления NaCl), обезвоживают спиртом и эфиром и затем высушивают в эксикаторе.

Метод Чаргаффа для приготовления РНК

Около 100 г спиртовых прессованных дрожжей промывают NaCl 0,14 м. и обезвоживают последовательной обработкой спиртом 50, 75, 95 и 100%. Затем взвешивают в смеси из равных частей NaCl 0,14 м. и спирта 95%. Взвесь подвергают механическому растиранию (Waring blendor) и добавляют 2 объема спирта 70%.

Осадок обезвоживают промыванием спиртом и эфиром, затем высушивают в вакууме. Получаемый порошок дважды экстрагируют по 100 мл NaCl 10% при 90°, в течение 30 минут. Экстракты соединяют, причем к ним добавляют 2 объема спирта. Образовавшийся осадок промывают спиртом и эфиром и затем берут с 35 мл
воды и центрифугируют. К надосадочной жидкости добавляют 1/4 объема раствора ацетата бария 20% (pH 7) и 1 объем спирта. Образовавшийся осадок промывают ацетатом бария 5% и затем взвешивают в 18 мл воды, к которой для растворения добавляют 0,15 г сульфата натрия. Раствор просветляют центрифугированием. Надосадочную жидкость подвергают депротеинизации посредством промывания хлороформо-октиловой смесью (9:1), после чего центрифугируют. Надосадочный раствор вновь осаждают 2,5 объемами холодного спирта, к которому добавлена НС1 до 0,05 н. концентрации. Оставляют на ночь при + 4°С, а затем осадок собранный посредством центрифугирования, снова растворяют в воде (добавляют весьма малое количество аммиака для того, чтобы довести значение pH до 6,0). РНК снова осаждают из этого раствора с помощью подкисленного спирта. В конечном итоге осадок промывают спиртом и эфиром и высушивают в эксикаторе.

Приготовление лецитина

К 1 литру свежих куриных желтков добавляют, непрерывно помешивая, 3 литра спирта 95%. Центрифугируют. Осадок берут в 2 литрах горячего спирта 95%. Центрифугируют, после чего осадок подвергают повторной вытяжке горячим спиртом.

Все три спиртовые вытяжки оставляют на ночь на холоде (+ 4°), фильтруют, а фильтрат осаждают водным раствором хлористого кадмия 50%, добавляемым небольшими порциями, для того, чтобы приостановить присоединение в момент, когда осаждение прекращается (всего приливают около 120 мл), центрифугируют, затем осадок промывают 400 мл спирта. К осадку добавляют 400 мл эфира и небольшой объем воды (около 40 мл) до растворения. Раствор обрабатывают 1 объемом спирта, а образовавшийся осадок снова растворяют в 400 мл эфира и необходимом количестве воды. К этому раствору сначала добавляют 400 мл этилового спирта, содержащего концентрированную соляную кислоту 10% и затем 800 мл раствора NaCl 2%, охлажденного при нуле градусов. Центрифугируют. Нижнюю водно-спиртовую фазу удаляют путем всасывания. Эфирную фазу снова обрабатывают метанолосолянокислой смесью и хлористым натрием (как и выше), а затем обрабатывают только 200 мл метилового спирта (без НС1) и 400 мл холодного NaCl 2%.
Эту третью эфирную фазу обрабатывают 600 мл ацетона для осаждения лецитина. Осадок промывают ацетоном, затем снова растворяют в 50 мл эфира и осаждают ацетоном (200 мл).

Этот последний осадок снова растворяют в 100 мл эфира, к которому добавляют 10 мл ацетона. Оставляют на ночь на холоде (+ 4°С), а затем образовавшийся осадок удаляют центрифугированием, причем надосадочную жидкость выпаривают в вакууме при 30°С.

В целях удаления из этого препарата нехолиновых липидов–операция, соответствующая последней очистке лецитина – осадок, остающийся после выпаривания, обрабатывают 600 мл абсолютного спирта и фильтруют. Затем на 1 мл определяют концентрацию сухого вещества в фильтрате, причем этот последний разбавляют до эквивалента 5% сухого осадка.

Этот раствор адсорбируют на алюминиевой колонке диаметром 4 см, содержащей пятикратное количество алюминия по сравнению с количеством сухого вещества.

Таким образом получается бесцветный спиртной раствор, содержащий около 4% лецитина. Этот последний отличается следующими характеристиками: N = 3,73%; Р = 3,86%; соотношение N/P *= 0,97... 1,0; йодное число = 63.

Метод Гейдельбергера для приготовления капсулярного полисахарида пневмококка

Прозрачный фильтрат культуры за 72 часа в 10 л глюкозированного 0,3% бульона концентрируют в вакууме при 35°С до объема в 1 литр. Добавляют 100 г кристаллического ацетата натрия и 1250 мл спирта 95%. Встряхивают. Образовавшийся полисахаридный осадок собирают центрифугированием и растворяют в 250 мл раствора ацетата натрия 4%, слегка подкисляют (синяя окраска лакмуса). Добавляют 300 мл спирта 95%, а образовавшийся осадок снова растворяют в 250 мл раствора ацетата натрия 4% и 5 мл ледяной уксусной кислоты. Опалесцентную жидкость экстрагируют 50 мл хлороформа и 10 мл бутилового спирта в течение 1/2 часа. После центрифугирования растворители и образовавшуюся эмульсию удаляют, а раствор снова обрабатывают хлороформом и бутиловым спиртом. Эту экстракцию повторяют столько раз, сколько это необходимо до тех пор, пока не прекращается образование эмульсии.

Затем к раствору добавляют этанол (500 мл спирта на 250 мл раствора), а образовавшийся осадок растворяют в 250 мл воды. Из этого раствора фосфаты удаляют осаждением спирта в присутствии ацетата и уксусной кислоты. Для удаления гликогена к 250 мл раствора добавляют 20 мл насыщенного ацетата меди, слегка подкисленного уксусной кислотой. Пневмококковый полисахарид осаждают в этих условиях в виде медного соединения синего цвета. Затем его снова берут с 50 мл уксусного раствора ацетата натрия (20 г ацетата растворенного в 25 мл воды и 5 мл ледяной уксусной кислоты), затем снова осаждают одним объемом спирта. Такого рода осаждения повторяют до полного осаждения меди.

В конечном итоге полисахаридный раствор осаждают спиртом, промывают спиртом и эфиром и затем высушивают в эксикаторе.

Метод Фримэна для приготовления тифозного полисахарида

Микробные клетки собирают центрифугированием, промывают и обезвоживают ацетоном. К 30 г бацильного порошка добавляют 200 мл уксусной кислоты 0,1 н., причем взвесь нагревают в течение 90 мин. с орошением в водяной бане при 100°С, затем охлаждают и центрифугируют.

Надосадочную жидкость фильтруют через фильтр Чемберлена, затем фильтрат концентрируют в вакууме (50–60°С) до 8-й части исходного объема. После этого с концентратом проводятся следующие серийные осаждения:

• 6 фракционированных осаждений (со спиртом от 50% до 60%);
• 3 осаждения ледяной уксусной кислотой (94%);
• 2 осаждения 6-ю объемами спирта 95%.

Получаемый в результате последнего осаждения препарат дважды промывают спиртом и трижды эфиром. В конечном итоге препарат сушат в эксикаторе и сохраняют в виде порошка.