Нефелометрические методы
Оценка степени мутности той или иной среды может быть произведена с помощью методов, в основе которых лежат процессы аналогичные колориметрическим процессам. В этом последнем случае падающий луч подвергается селективной абсорбции. В случае прохождения через мутные среды падающий луч также теряет свою интенсивность, претерпевая видимо аналогичную абсорбцию. Однако это связано с диффузией падающих лучей, вследствие столкновения с частицами, являющимися причиной мутности раствора. Диффузия имеет место в случае, когда размеры встречаемых частиц превышают длину волны падающего луча. В случае измерения интенсивности света рассеянного исследуемой мутной жидкостью, метод называется нефелометрическим. Однако можно измерять также непрозрачность той или иной среды, оценивая снижение интенсивности падающего луча. В этом случае метод называется опациметрией. И наконец, в случае, когда измеряют толщину (или концентрацию) мутной среды, необходимую для того чтобы препятствовать наблюдению теста, расположенного позади этой среды, речь идет о турбидиметрии.
Использование этих методов дает возможность произвести дозировку тонких осадков, веществ в коллоидальном состоянии, подсчет клеток (красных кровяных шариков, микроорганизмов и др.), находящихся в какой-либо взвеси и т.д.
В общем, фотометрия мутных сред не является особо точным методом. Однако, довольно часто она приносит пользу при биологических исследованиях и тогда, когда получаемые результаты относятся к сопоставляемым образцам, ценность этого метода является довольно значительной.
Законы поглощения света в мутных средах дают возможность установить оптимальные условия измерения непрозрачности. Так, в случае, когда количество частиц, придающих взвеси непрозрачность весьма мало (сильное разбавление взвеси), поскольку частицы неокрашены, незначительных размеров и имеют сферическую форму, а коэффициент преломления частиц мало отличается от коэффициента преломления среды, интенсивность рассеянного света пропорциональна количеству диспергированных частиц, то есть концентрации определяемого вещества.
На практике осуществление этих условий может быть достигнуто посредством регулировки используемых фотометрических приспособлений, а также путем выбора методов, ведущих к образованию взвеси с тонкими, равномерными и как можно более устойчивыми частицами.
Так как в любом фотометрическом устройстве щель через которую выходит световой пучок нельзя считать бесконечно малой, следует, что помимо непосредственно передаваемого потока без отклонения (f), получают также и часть рассеянного потока (d), излучаемого в угол и, под которым наблюдается освещенная зона мутной среды.
Согласно вышеприведенному выражению, оптическая плотность не обладает каким-либо определенным значением и снижается по мере того как и увеличивается, как это например бывает, когда содержащая взвесь кювета находится вблизи наблюдателя. Если эта кювета достаточно близко расположена от приемника и если размеры частиц соответствуют нескольким микронам практически весь излучаемый поток доходит до приемника и таким образом становится весьма малым. Наоборот, на большом расстоянии D весьма велик, причем он может достигнуть бесконечности, если расстояние очень велико и величина непосредственно передаваемого потока становится ничтожной.
Следовательно, необходимо установить среднее подходящее положение кюветы в фотометрическом устройстве; кроме того, наряду с кюветой содержащей исследуемый образец, следует пользоваться еще одной контрольной кюветой, содержащей аналогично приготовленную взвесь, известной концентрации.
Опациметрия
Изменение интенсивности падающего луча, после того как этот последний прошел непрозрачную исследуемую жидкость, можно оценить с помощью любого прибора, применяемого для колориметрических определений.
Однако необходимо учесть вышесказанное относительно размера щели, через которую проходит падающий свет, а также расстояние между кюветой и приемником. Помимо этого следует обеспечить получение частиц постоянного среднего размера, которые не должны оседать на всем протяжении операции, связанной с определением.
Условия работы в опациметрии можно улучшить, используя диффузио- абсорбциометр типа Догнана, схема которого показана на рис. 7. Аппарат содержит три фотоэлемента (Р15 Р2 и Р3), причем световой пучок исходит от S вправо для обеспечения компенсации (см. предыдущий раздел, описание электрофотометра) а левый пучок осуществляет измерение. Установление равновесия на гальванометре G необходимо производить лишь один раз, когда вводится кювета, содержащая только растворитель («слепой образец»). В последующем, когда растворитель заменяется дозируемой взвесью (или окрашенным раствором, в случае колориметрического определения) поскольку равновесие гальванометра (микроамперметра) нарушается, этот последний отклоняется. Это отклонение весьма чувствительно измеряет процентную абсорбцию.
Рис. 7 – Схематическое изображение диффузиоабсорбциометра типа Догнана. 5 – источник света; Fx и F* – щели: L – конденсирующая линза; D – диафрагма с радужной оболочкой: G – гальванометр; Pi, Р* и Рж – клетки фотоэлементов; С и С' – положения кюветы.
В случае оценки интенсивности абсорбции, происходящей за счет цветного эффекта, между пучком света и кюветой вводится эталон (пунктированный на рис. 7), абсорбционная мощность которого известна. Затем отклонение гальванометра регулируется до желаемого значения посредством незначительного изменения светового потока.
Для опациметрии применение диффузиоабсорбциометра типа Догнана имеет следующее важное преимущество. В этом приборе кювета с исследуемой взвесью может быть установлена на различных расстояниях, либо ближе к приемнику (положение С на рис. 7), либо к источнику света (положение С '). Соотношение абсорбции в обоих крайних положениях дает значение характерное для размера находящихся в взвеси частиц.
Применяя тот же способ с помощью прибора Догнана, можно измерить вызываемую диффузией абсорбцию, независимо от окраски среды. Для этого необходимо чтобы кювета с образцом прилегала к приемнику (позиция С). Для этой абсорбции гальванометр уравновешивается посредством уменьшения потока на компенсационном фотоэлементе. Отодвигая затем кювету в крайнее положение (позиция С '), наблюдается дополнительная абсорбция, имеющая место только за счет диффузии, которую называют «показателем диффузии». Этот показатель зависит только от концентрации и размера частиц.
Нефелометрия
Нефелометрия служит для непосредственного измерения света, рассеиваемого в направлении почти перпендикулярном к направлению падающего пучка.
Применение нефелометрии возможно даже с помощью обычных фотометрических приборов, как например колориметра Дюбоска (рис. 4). Для этой цели аппарат подвергается изменению путем использования иммерсионных палочек, предварительно покрытых черным водонерастворимым лаком, для того чтобы свет мог проникать только через нижнюю часть палочки. Кроме того, освещение кювет уже не производится снизу вверх, а сбоку, под углом 90° по отношению к оси иммерсионных палочек. В остальном поступают также как и при колориметрировании, применяя метод выравнивания интенсивности света в обеих половинах зрительного поля.
Нефелометрические измерения можно проводить также с использованием фотометра Пульфриха или диффузиоабсорбциометра типа Догнана. Для этой цели оба эти прибора оснащены специальными приспособлениями.
На фотометре Пульфриха измерение состоит в сравнении интенсивности бокового освещения за счет диффузии падающего излучения, которое уменьшают в достаточной мере с помощью диафрагмы типа« кошачьего глаза» (рис. 5, К и К’). Это диафрагмирование соответствует термину (впрочем, неподходящему диффузионной плотности». Во избежание различий в окраске между прямым и рассеянным светом применяются специальные селективные светофильтры (рис. 5, F и F').
В случае диффузиоабсорбциометра типа Догнана свет рассеянный в боковом направлении измеряется третьим фотоэлементом (рис. 7, Ра), расположенным под содержащей образец кюветой. Интенсивность этого света выражается в процентах по отношению к интенсивности падающего света.
В течение второго этапа гальванометр подключается к фотоэлементу Р8, в кювету помещают дозируемую взвесь и затем производится оценка интенсивности рассеянного излучения.
Турбидиметрия
Этот метод состоит в изучении мутных сред посредством определения толщины, препятствующей наблюдению определенного теста (нить лампочки, сетка и др.). Тест уже нельзя обнаружить, когда его видимая люминесценция становится достаточно близкой к люминесценции периферического поля, то есть к освещенной зоне мутной среды. Эта люминесценция периферического поля усиливается по мере роста количества находящихся во взвеси частиц, а также увеличения их размера.
В биохимических исследованиях турбидиметрические методы применяются очень редко. Они широко используются в промышленности.
Нефелометрическое определение хлоридов
В присутствии азотнокислого серебра хлориды дают тонкий осадок нерастворимого хлористого серебра. Количество образуемого осадка пропорционально количеству присутствующих в образце хлоридов. Образующийся осадок может быть определен количественно нефелометрически, подвергая его сравнению с диффузионной способностью стандартного раствора.
Стандартный раствор приготовляется растворением 21,28 г КС1 в 100 мл бидистиллированной воды (в мерной колбе). Этот раствор содержит в каждом мл 0,1 мг хлора.
Из этого раствора в три мерные колбы по 50 мл вливают по 2,5 мл, 5 мл и 7,5 мл, причем эти количества отмеряются весьма точно. В четвертую мерную колбу на 50 мл вводятся 5 мл исследуемого препарата.
Затем во все четыре колбы добавляют:
— по 20 мл 96% спирта;
— по 10 мл HNOs 0,1 н;
— по 10 мл AgN03 0,005 н.
Содержимое всех колб доводится бидистилированной водой до метки, затем колбы ставятся на 30 минут в водяную баню с температурой 40° С. После охлаждения до комнатной температуры в кювету нефелометра (после предварительного взбалтывания) вводится образец, а во вторую кювету вводится одна из контрольных проб (после предварительного взбалтывания). Контрольная проба фиксируется в определенной точке, затем между контрольной пробой и образцом, посредством соответствующего манипулирования прибора устанавливается оптическое равновесие. В случае необходимости контрольная проба заменяется другой, более концентрированной (или более разбавленной).
После того как установлено значение С, количество хлора, содержащегося в 100 мл препарата будет: G=20 x20xC.
