Окислительные энзиматические системы, определяемые с помощью аппарата Варбурга

Активность этих энзиматических систем можно определять с помощью аппарата Варбурга, либо непосредственно, либо с использованием акцепторов водорода (диафораза, метиленовая синь и др.)

Энзимы, непосредственно фиксирующие кислород

Активность медистых энзимов (оксидаза аскорбиновой кислоты, тирозиназа и фенолооксидазы), а также и других окислительных энзимов, (гистаминаза, аминокислотоксидазы, уриказа, липоксидаза и др.) определяют измерением количества молекулярного кислорода, расходуемого известным количеством энзима в течение данного промежутка времени. Кроме того, устанавливают pH системы, используемую температуру и количество присутствующего в системе субстрата. Получаемые результаты обычно выражаются в см3 (или мм3) О2, потребляемых в течение одного часа эквивалентом 1 г сухого вещества (или 1 мг белкового N), присутствующего в исследуемом энзиматическом препарате.

Так как необходимо определить количество израсходованного кислорода, во внутренние чашки реакционных сосудов аппарата Варбурга вводят раствор NaOH 15%. В реакционный сосуд вводят: 1 мл энзиматического препарата и 2 мл субстрата, растворенного в буферном растворе.

Субстрат различается в зависимости от соответствующего энзима.

а) Для оксидазы аскорбиновой кислоты применяют раствор аскорбиновой кислоты 0,01 н. в буферном фосфатном растворе м/15 с pH 5,6–6,0.

Энзим является специфичным не только по отношению к аскорбиновой кислоте, но и к следующим его производным: D-арабоаскорбиновая кислота, L-глюкоаскорбиновая кислота и L-галактоаскорбиновая кислота, которые можно использовать в качестве субстрата. Оптимальная температура – 26 градусов.

б) Для фенолоксидаз применяют раствор орто- или парагидрофенолов, например гидрохинон 0,01 н. в буферном фосфатном растворе м/15 с pH 6,0 –6,5. Оптимальная температура: 30–37°.

в) Для аминокислотооксидаз применяют изомеры L или D соответствующих аминокислот в виде раствора 0,01 н в буферном фосфатном растворе с pH 6,8–7,3. Оптимальная температура: 37°.

г) Для уриказы: 0,2 мг урата на 100 мл боратного буферного паствора ОД м с pH 9. Оптимальная температура: 39°.

д) Для липоксидазы: линолиновую кислоту 1 % в буферном фосфатном растворе 0,15 м с pH 6,5. Оптимальная температура: 37°.

Ингибиторы энзиматических реакций:

Медистые энзимы ингибируются цианидом, диэтилдитиокарбаматом, 8-гидроксихинолином и этилксантатом калия; сероводород и окись углерода влияния не оказывают.

Аминокислотные оксидазы ингибируются различным образом: D- аминокислотоксидаза чувствительна на действие бензойной кислоты и ингибируется цианидом; моно- и диаминооксидазы (тираминаза, гистаминаза) ингибируются цианидом и мочевиной, не реагируя на действие карбониловых реактивов.

Уриказа инактивируется синильной кислотой, причем ее активность стимулируется цистеином.

Активность оксидазы аскорбиновой кислоты можно определить также с помощью титриметрического метода, используя для этой цели йодный раствор или 2,6-дихлорофенолиндофенол. Таким образом, устанавливают количество неокисленной аскорбиновой кислоты и подсчитывая разницу можно определить значение субстрата, окисленного в течение известного промежутка времени.

Аналогичным титриметрическим методом можно пользоваться для определения активности тирозиназы – медистый энзим типа фенолоксидаз, катализирующий окисление адреналина, катехола, фенола, тирозина, мета- и паракрезола, пирогаллола и 3,4-дигидроксифенилаланина (ДОПА).

Энзимы косвенно фиксирующие кислород

Активность пиридиннуклеотидных дегидрогеназ, а также флавин- энзимов (диафораза, энзима Шардингера) можно установить с помощью аппарата Варбурга, определяя количество молекулярного кислорода, потребляемого рассматриваемым энзиматическим препаратом, когда он находится в присутствии специфического субстрата и водородного акцептора.

Среди окислительных энзимов, активность которых стимулируется присутствием пиридиннуклеотидов (дифосфопиридиннуклеотид: ДПН и трифосфопиридиннуклеотид: ТПН), в зависимости от катализируемого специфического субстрата, были идентифицированы следующие дегидрогеназы: лимонная (изолимонная), фумариновая, яблочная, молочная, янтарная, глютаминовая, а-глицерофосфорная, эфира Робинсона, глюкозы, спирта и др. Обычно, соответствующий субстрат применяют в концентрации 0,1 м в буферном растворе 0,15 м с pH 7,2.

В качестве водородного акцептора для определения активности пиридиннуклеодтиных дегидрогеназ, используют либо диафоразу как таковую, либо вместе с метиленовой синью (кристаллфиолетовый или другое подходящее окрашивающее вещество).

Диафораза представляет собой флавиновый энзим, который приготовляют из надпочечников. В весьма малых количествах она присутствует в важдой клетке, так как способствует окислению пиридиннуклеотидов,
восстановленных в результате акцептирования водорода от субстрата ДПН Н+.

Повторное окисление таким образом восстановленной диафоразы можно осуществить двумя путями:

а) посредством цитохромной системы, переводящей электроны вплоть до кислорода;

б) Посредством кислородоакцепторных красителей, как например, метиленовая синь.

Окисление пиридиннуклеотидов диафоразой и дальнейший перевод водорода посредством метиленовой сини на молекулярный кислород позволяет установить каличество диафоразы присутствующей в анализируемом препарате. Способ, который описали Корран, Грини Штрауб, применяет в качестве источника ДПН молочную дегидрогеназу; в присутствии лактата образуется дигидрокоэнзим (ДПН Н+), являющийся субстратом диафоразы. Этот последний окисляет восстановленую ДПН и затем передает водород метиленовой сини, которую добавляют к системе. Благодаря метиленовой сини водород фиксируется на атмосферном кислороде, на основании чего можно установить количество диафоразы, определяя количество израсходованного молекулярного кислорода. Определение производят в аппарате Варбурга, причем в реакционный сосуд с помощью пипетки вводят:
1,5 мл раствора молочной дегидрогеназы
0,2 мл раствора лактата 0,1 н. в фосфатном буферном растворе 0,15 м, с pH 7,5.
0,2 мл раствора цианистого калия 2 н.
0,2 мл раствора метиленовой сини.
0,1 мл диафоразного препарата.

В систему добавляют цианид для блокировки пирувата, образовавшегося в результате дегидрирования лактата, поскольку этот последний ингибирует реакцию. Интенсивность каталитического процесса можно повысить добавляя коэнзим (1,0 мл ДПН 0,075%).

Энзим Шардингера (ксантиноксидаза или альдегидраза) – это другой флавиновый энзим, активность которого можно определить аналогичным образом. В качестве субстрата применяется гидратированная форма гипоксантина или ксантина, которые в результате специфического действия энзима, дегидрируются в ксантин и соответственно в мочевую кислоту. Тот же процесс происходит и в случае воздействия энзима на гидратированные формы альдегидов (алифатических или ароматических).

Для определения активности пиридиннуклеотидных дегидрогеназ может быть использован метод Варбурга, но при условии, чтобы в реакционном сосуде, наряду с субстратом и энзиматическим препаратом присутствовали диафораза и метиленовая синь. Введение диафоразы является обязательным, когда используются очищенные энзиматические препараты не содержащие клеток и в которых, следовательно, следы диафоразы отсутствуют. В этом случае диафоразу вводят в боковое разветвление реакционного сосуда, смешивая с остальной системой в момент начала определения. Реакционная система должна содержать: 1,6 мл раствора субстрата 0,1 м в фосфатном буферном растворе 0,15 м. с pH 7,0 – 7,5;
0,1 мл диафоразы 0,001%;
0,2 мл метиленовой сини 5%;
0,1 мл цианистого калия 1%;
1 мл энзиматического препарата.

Целью добавления цианистого калия является ограничение энзиматического процесса только для проведения дегидрирования, катализируемого системой ДПН – диафораза метиленовая синь - 02. Так, например, в случае яблочной и спиртовой дегидрогеназы, цианистый йон приостанавливает ингибирующий эффект щавелевоуксусной кислоты.

Пиридиннуклеотидные дегирогеназы не ингибируются в присутствии цианида. Однако, их ингибирует йодоуксусная кислота, непосредственно реагирующая с апоэнзимом. Коэнзимы I или II интенсифицируют активность этих энзимов; кроме того, ионы двухвалентных металлов (Мп++, Mg++), иногда аденозинтрифосфат (формалиновый дегидрогеназ) и др. Пирофосфаты удаляют из раствора ионы двухвалентных металлов, вследствие чего энзиматическая активность ингибируется.