Определение белков крови

Для рефрактометрического определения общего белка необходимо следующее оснащение рабочего места:

1. Штатив для пробирок.
2. Пастеровские пипетки.
3. Центрифужные пробирки (желательно толстостенные с широким донышком).
4. Стеклянные палочки.
5. Водяная баня.
6. Рефрактометр марки РЛУ (Киев).

Для проведения электрофореза на бумаге необходимо следующее оснащение рабочего места:

1. Аппарат для электрофореза (ЭФА-1).
2. Пробирки.
3. Колбочки на 50 мл.
4. Пипетки на 10 мл.
5. Микропипетки.
6. Стеклянная рамка.
7. Сушильный шкаф.
8. Кюветы.
9. Ножницы.
10. Фотоэлектроколориметр (ФЭК).
11. Мединал.
12. Веронал.
13. Бромфеноловый синий.
14. Сулема (HgCl2).
15. Ледяная уксусная кислота.
16. Едкий натр.
17. Хроматографическая бумага № 1.

Для исследования необходима сыворотка крови.

Определение общего белка кропи с помощью рефрактометра марки РЛУ

Сущность метода состоит в определении коэффициента преломления сыворотки, величина которого зависит от содержания в ней общего белка. Коэффициент преломления сыворотки устанавливают с помощью специального прибора — рефрактометра (рис. 85). Для этого метода необходимы следующие реактивы:

1. Насыщенный раствор сернокислого аммония: 75,4 г химически чистого (NH4)2S04 растворяют в 100 мл воды.
2. 0,04 N раствор уксусной кислоты: 2,28 мл ледяной уксусной кислоты разводят в воде и объем раствора до¬водят водой до объема 1 л.

Рис. 85. Общий вид рефрактометра (а), горизонтальное положение камеры (б)

Проверка нулевой точки рефрактометра

Для определения нулевой точки рефрактометра камеру со зрительной трубкой переводят в горизонтальное положение (см. рис. 85, б). Приподнимают верхнюю половину камеры и на призму наносят 1-2 капли дистиллированной воды. Закрывают камеру. С помощью зеркала направляют свет в окно камеры. Поворотом винта достигают резкой границы светотени. Окуляр шкалы и окуляр зри¬тельной трубки устанавливают на резкость. Линию окуляра шкалы устанавливают на 1,3330 и в зрительную трубку наблюдают границы светотени по отношению к точке пересечения двух взаимно перпендикулярных линий. Совпадение границы светотени с точкой пересечения линии указывает на то, что прибор установлен на нуль. При несовпадении границы светотени на корпусе зрительной трубки с помощью ключа и маленького винта ставят границу светотени на точку пересечения линий. Обе призмы камеры вытирают фильтровальной бумагой, а затем досуха протирают мягкой неворсистой тряпочкой.

Техника определения общего количества белка

На поверхность призмы наносят 1-2 капли исследуемой сыворотки крови и быстро закрывают камеру. Поворачивают камеру до момента совпадения границы светотени с точкой пересечения двух линий. Этот момент устанавливают при наблюдении через окуляр. По шкале производят отсчет показателя коэффициента преломления сыворотки и по табл. 12 устанавливают содержание белка в процентах.

Так, например, если показатель коэффициента преломления сыворотки равен 1,34388, то ему по таблице соответствует 4,6% белка.

После определения обе призмы тщательно промывают дистиллированной водой и досуха протирают фильтровальной бумагой и мягкой тряпочкой.

В сыворотке крови здоровых людей содержится от 6 до 8.5% общего белка.

Определение альбуминов и глобулинов с помощью рефрактометра марки РЛУ

В штатив устанавливают четыре пронумерованные центрифужные пробирки с пробками. В пробирки № 1 и 3 наливают по 1 мл 0,04 N раствора уксусной кислоты. В пробирки № 1 и 2 наливают по 1 мл исследуемой сыворотки крови. Затем в пробирки № 3 и 4 вносят по 1 мл дистиллированной воды и этой же пипеткой, промытой несколько раз насыщенным раствором сернокислого аммония, в пробирки № 2 и 4 вносят по 1 мл насыщенного раствора, после чего все пробирки тотчас же закрывают пробками.

Содержимое пробирок взбалтывают, поколачивая их о ладонь, не менее 20 раз (все пробирки взбалтывают одинаковое число раз), после чего содержимое пробирки № 1 кипятят в водяной бане в течение 3 минут. Отделив свернувшийся белок от стенок пробирки стеклянной палочкой, смесь центрифугируют не менее 5 минут (1500-2000 об/мин). Центрифугат должен быть прозрачным.

Содержимое пробирки № 2 центрифугируют в течение 20-30 минут, центрифугат также должен быть прозрачным. Затем с помощью рефрактометра определяют коэффициент преломления реактивов каждой пробирки в отдельности.

Определение начинают с пробирки № 3, в которой 0,04 N раствор уксусной кислоты разведен в 2 раза дистиллированной водой, и № 4, содержащей насыщенный раствор сернокислого аммония, разведенный в 2 раза дистиллированной водой. Вслед за тем определяют коэффициент преломления центрифугата в пробирке № 1. Центрифугат этой пробирки не содержит белков, поскольку прибавление к сыворотке крови 0,04 N раствора уксусной кислоты и последующее кипячение содержимого пробирки ведут к осаждению белка.

В последнюю очередь определяют коэффициент преломления центрифугата пробирки № 2 (этот центрифугат содержит только альбумины, так как добавление насыщенного раствора сернокислого аммония приводит к осаждению глобулинов).

При определении коэффициента преломления каплю содержимого из каждой пробирки наносят на призму рефрактометра чистой сухой пастеровской пипеткой. После каждого определения призму промывают водой и протирают досуха фильтровальной бумагой и мягкой тряпочкой.

Определение производят при температуре 20°. При необходимости создают постоянную температуру, пропуская с помощью имеющегося в приборе приспособления проточную воду температурой 20°.

В результате исследования могут, например, получиться следующие показатели:

1. Коэффициент преломления цельной сыворотки (общий белок) — 1,3490.
2. Коэффициент преломления воды (величина постоянная) — 1,3330.
3. Коэффициент преломления безбелкового центрифугата —1,3340 (пробирка № 1).
4. Коэффициент преломления альбуминов — 1,3758 (пробирка № 2).
5. Коэффициент преломления 0,04 N раствора уксусной кислоты — 1,3331 (пробирка № 3).
6. Коэффициент преломления полунасыщенного раство¬ра сернокислого аммония — 1,3710 (пробирка № 4).

Перевод коэффициента преломления, установленного по шкале рефрактометра, в проценты белка производят по таблице Рейсса (см. табл. 12).

Пример расчета.

1. Если коэффициент преломления цельной сыворотки равен 1,3490, то по таблице Рейсса он соответствует 7,63% общего белка.

2. Чтобы определить процентное содержание альбуминов, поступают следующим образом:

• коэффициент преломления альбуминов по шкале рефрактометра 1,3758; из коэффициента преломления альбуминов вычитают показатель преломления насыщенного раствора сернокислого аммония: 1,3758—1,3710 = 0,0048; ввиду разведения насыщенного раствора (NH4)2S04 в 2 раза полученный результат умножают на 2: (0,0048X2 = = 0,0096);
• определяют истинное преломление безбелковых веществ — из показателя преломления безбелковых веществ вычитают показатель преломления разведенного вдвое 0,04 N раствора - СНзСООН: 1,3340-1,3331 = 0,0009; 0,0009X2 = 0,0018;
• определяют истинное преломление альбуминов — из коэффициента преломления альбуминов (0,0096) вычитают коэффициент преломления безбелковых веществ, 0,0096-0,0018 = 0,0078;
• определяют содержание альбуминов — коэффициент истинного преломления альбуминов делят на 0,00177 — коэффициент преломления 1% раствора альбуминов: 0,0078:0,00177 = 4,4%.

3. Чтобы определить содержание глобулинов, суммарный коэффициент преломления воды, безбелковых веществ и альбуминов вычитают из коэффициента преломления цельной сыворотки (общего белка) и делят на 0,00229 — коэффициент преломления 1% раствора глобулинов: а) 0.0096 + 1.3330=1,3426; б) 1,3490-1,3426 = 0,0064; в) 0,0064:0,00229 = 2,8%.

4. Для определения коэффициента соотношения альбуминов и глобулинов показатели содержания альбуминов делят на содержание глобулинов.

Определение фракции сывороточных белков с помощью электрофореза на бумаге (по А. Е. Гурвичу)

Сущность метода состоит в разделении белков сыворотки на бумаге с помощью электрофореза. Разделенные белки выявляются с помощью обработки полосок бумаги специальными красителями, при этом удается выделить альбумины и фракции глобулинов.

Для этого метода пользуются следующими реактивами:

1. Вероналовый буфер (рН 8,6): 10,32 г мединала растворяют в мерной колбе на 1 л в 800 мл дистиллированной воды с добавлением 1,84 г веронала. Смесь нагревают на водяной бане до растворения веронала, а затем охлаждают; объем раствора доводят до 1 л.
2. Краситель для окраски электрофореграмм: бромфенолового синего 0,05 г, сулемы 1 г, ледяной уксусной кислоты 2 мл, дистиллированной воды 98 мл.
3. 2% раствор уксусной кислоты — 2 мл ледяной уксусной кислоты на 100 мл раствора.
4. 0,1 N раствор NaOH: 2 г едкого натра помещают в мерную колбу на 500 мл и доливают водой до метки.
5.  0,01 N раствор NaOH: 10 мл 0,1 N NaOH помещают в колбочку на 100 мл и доводят до метки дистиллированной водой. Этот реактив готовится перед началом исследования.
6. Хроматографическая бумага № 1.

Техника проведения электрофореза

Устанавливают аппарат для электрофореза согласно указаниям инструкции к прибору. Затем хроматографическую бумагу № 1 нарезают на полоски размером 4 X 44 см, в центре бумажных полосок простым карандашом наносят одну поперечную черту, а на расстоянии 4 см от нее — другую. С этой же стороны, у конца бумажной полоски, карандашом надписывают дату исследования и фамилию обследуемого.

Подготовленную таким образом полоску бумаги равномерно натягивают на рамку прибора, которую помещают в камеру, предварительно заполненную буферным раствором. Концы бумажных полосок должны быть погружены в буферный раствор. При этом та часть бумажной полоски, на которой помечена фамилия обследуемого и дата исследования, должна быть обращена к катоду. Прибор закрывают крышкой и выжидают, пока бумажные полоски пропитаются буферным раствором. После этого крышку снимают и на черту, находящуюся на расстоянии 4 см от черты, проведенной карандашом в центре полоски, микропипеткой наносят 0,01-0,005 мл исследуемой сыворотки.

Если, например, необходимо нанести 0,01 мл сыворотки, то в микропипетку на 0,1 мл набирают 0,085 мл сыворотки и, едва касаясь полоски бумаги, осторожно спускают взятую сыворотку до метки 0,095 мл, распределяя ее по всей длине черты.

Наносить сыворотку у самых краев бумаги не следует.

После нанесения сыворотки прибор закрывают крышкой и подключают к сети. Электрофорез проводят при комнатной температуре. Хорошее разделение сыворотки происходит при 127—210 V в течение 18 часов. По окончании электрофореза ток выключают, крышку снимают, бумажные полоски извлекают, подвешивают горизонтально на специальной рамке (рис. 86) и помещают на 20 минут в сушильный шкаф при температуре 105°. Затем их погружают в кювету с красителем и окрашивают в течение 20 минут бромфеноловым синим. Краситель сливают, а электрофореграммы последовательно в нескольких порциях промывают в 2% растворе уксусной кислоты до тех пор, пока фон фореграммы полностью не отмоется от красителя (рис. 87). Во время окраски и отмывания полоски хроматографической бумаги не должны сворачиваться и накладываться друг па друга. В результате окраски на ленте выявляются окрашенные участки, соответствующие альбуминам альфа, бетта и гамма-глобулинам.

Рис. 86. Стеклянная рамка для подвешивания бумаги

После отмывания полоски бумаги высушивают при комнатной температуре и разрезают на отдельные участки, соответствующие отдельным белковым фракциям.

При этом участки, относящиеся к альбуминовой фракции, помещают в отдельную колбочку на 50 мл, а участки, относящиеся к аг-, fi- и у-глобулинам, — в отдельные химические пробирки. К альбуминовому участку добавляют 30 мл, а к глобулиновым — по 10 мл 0,01 N раствора NaOH для извлечения (элюции) белка, окрашенного бромфеноловым синим.

Участок электрофореграммы, не содержащей белка, разрезают на кусочки шириной 1-1,5 см, помещают в отдельную химическую пробирку, предназначенную для контроля, и добавляют 10 мл 0,01 N раствор NaOH.
Колбочку и пробирки оставляют на один час при комнатной температуре для полноты извлечения.

Сразу же после окончания элюции определяют интенсивность окраски элюатов на фотоэлектроколориметре, пользуясь правым барабаном, при красном светофильтре. Кюветы используют с расстоянием рабочих граней 20 мм, колориметрирование ведут против контроля (элюат фонофореграммы).

Экстинкцию, полученную при колориметрировании фракции альбуминов, умножают на 3 в связи с тем, что для элюирования этой фракции было использовано 30 мл 0,01 N раствора щелочи.

Найденные для каждой фракции величины экстинкций складывают. Полученную сумму принимают за 100%. Например: экстинкция альбуминов 0,135X3 = 0,405;

альфа1-глобулинов    0,048;

альфа2-глобулинов    0,065;

бетта-глобулинов    0,075;

гамма-глобулинов    0,080;

Сумма экстинкций — 0,405 + 0,048 + 0,065 + 0,075 + + 0,080 = 0,673.

Принимая сумму за 100%, рассчитываем содержание каждой фракции в процентах. Содержание остальных фракций рассчитывают аналогичным образом.

Нормальное содержание белковых фракций в сыворотке крови в процентах составляет: альбумины 53-63; альфа1-глобулины 3,8-6,2; альфа2-глобулины 6,5-10,5; бетта-глобулины 10,0-15; гамма-глобулины 14,5-19,5.