Определение белковых соединений в крови

Общие белки

Рефрактометрический метод

Принцип: Коэффициент преломления сыворотки пропорционален количеству содержимых в сыворотке белков.

Таким образом, в основе рефрактометрии лежит определение коэффициента преломления исследуемого вещества.   

Как известно, коэффициентом преломления называется соотношение между синусом угла падения (i) луча и синусом его угла (г) преломления. Когда луч света переходит из одной среды в другую и
меняет направление, то он преломляется. Степень преломления вызываемого тем или иным раствором определяется количеством, размером и физическим состоянием растворенных частиц, а также температурой внешней среды.

В биологических жидкостях (плазма, сыворотка, экссудаты, транссудаты и др.) преломление следовательно зависит в первую очередь от количества белков. Небелковые вещества и соли имеют менее важную роль, причем предполагается, что эти последние дают постоянные значения.

А. Рефрактометр Цейсса (рис. 33) состоит из оптической трубки, на которой установлены следующие устройства:

1.  Призма Р, которая погружается в исследуемую жидкость. Прибор оснащен набором призм: Lx, L2, L3... L10.

Рис. 33. Рефрактометр Цейсса.

2. Объектив Ob, окуляр Ок и шкала Sk. При определении белков на шкале появляются два поля: одно освещенное, а другое более затемненное (рис. 34).

Рис. 34. Шкала рефрактометра Цейсса

Линия разделяющая оба поля должна быть четкой, без окрашенных изображений, вызываемых рассеянием света. Для того, чтобы достигнуть этого, вращают винт R. Если разделяющая линия располагается между двумя делениями, например 44–45, микрометрический винт Z необходимо поворачивать таким образом, чтобы линия достигла первого деления (44). Десятичные доли деления, отсчитываемые на микрометрической шкале затем добавляются к этому делению.

3. Компенсационная призма А, устраняющая рассеяние света, которую приводят в действие посредством кольца R.

Б. Водяная баня (рис. 35) имеет стеклянное дно и оснащена зеркалом О для направления светового луча. Так как коэффициент преломления изменяется в зависимости от температуры, работы следует производить при постоянной температуре 17°5, точно определяемой термометром t.

Рис. 35. Баня для рефрактометрии

Баня предусмотрена металлическим стержнем, на который рефрактометр опирается во время определения, а также штативом, на котором устанавливается стаканчик, в который наливают исследуемую жидкость.

Существуют также бани предусмотренные термо-электрическим приспособлением для автоматической регулировки температуры (ультратермостат Геттера).

Источником света должен быть белый свет, матовая электрическая лампа или еще лучше монохроматический свет (лампа с парами натрии) Техника. В баню вливают воду и доводят температуру до 1705. Если располагают большим количеством жидкости (экссудата и др.), то ее наливают в стакан, помещаемый в баню и в него погружают призму рефрактометра. В случае сыворотки, так как количество слишком мало, рефрактометр держат горизонтально, причем на призму Р наносят каплю сыворотки, затем покрывают дополнительной призмой, которая зажимается металлической оправой. Нижнюю часть рефрактометра погружают непосредственно в баню, причем рефрактометр опирается на стержень Ь.

Зеркало О устанавливают таким образом, чтобы оно отражало свет в призму и по истечении 10 минут необходимых для выравнивания температуры производят отсчет как это было показано выше, поворачивая винт R и микрометрический винт Z и отсчитывая соответствующие деления и десятые доли делений.

Для расчета используется таблица XXVII.

Результат соответствующий десятичным долям делений рассчитывается интерполяцией.

Рефрактометр Аббэ (рис. 36) действует по тому же принципу, как и рефрактометр Цейсса. Луч света с зеркала 1 падает на призму 2, состоящую из двух половин, между которыми помещают сыворотку или исследуемое вещество.

Рис. 36. Рефрактометр Аббэ.

Вращением призмы достигают полного внутреннего отражения света поверхностью анализируемого вещества. Угол вращения призмы определяется посредством указателя на шкале 3. Подсчет на шкале производится с помощью лупы 4. Для поддержания постоянной температуры в металлической оправе призмы 2 циркулирует вода с помощью трубки 5. Температура воды контролируется термометром 6. В качестве источника света рефрактометр Аббэ использует только белый свет. В этом случае в окуляре 7 получается окрашенная граница разделения поля. Для того, чтобы получить более четкую границу разделения, в нижней части трубки также существует компенсатор, состоящий из двух небольших призм, вращающихся в противоположные направления. Вращением этих призм получают четкую границу разделения поля.

Техника. Между призмами вводят 2–3 капли сыворотки или исследуемого вещества. Рефрактометр закрывают, а температуру регулируют на 37°. При вращении зеркала призмы хорошо освещаются белым светом. Когда температура уравновешена, приступают к отсчету, вращая призмы для того, чтобы в окуляре 7 получить затемненное поле. Если граница разделения затемненного поля не ясна, а окрашена, компенсатор вращают до получения четкой границы разделения. Затем вращают макрометрический винт для того, чтобы граница разделения совпадала с целым делением (на перекресте нитей). В заключение отмечается коэффициент преломления. Для расчета белков используется таблица XXVIII.

Примечания. Рефрактометр Цейсса дает более точные результаты, чем рефрактометр Аббэ, но нуждается в источнике монохроматического света.

Гравиметрический метод Хинсберг-Ланга

Принцип: Осаждаются общие белки и сывороточные фракции сульфатом аммония, а остатки высушиваются и взвешиваются.

Реактивы:

1. Буферный раствор: 53 г ацетата натрия и 28 мл ледяной уксусной кислоты растворяют в дистиллированной воде дополняя объем до 1000 мл.
2. Насыщенный раствор сульфата аммония. 100 г чистого сульфата аммония и 125 мл дистиллированной воды хорошо взбалтывают в течение продолжительного времени, оставляя в покое на следующий день и фильтруют. pH раствора 6,2 – 6,4.
3. Спиртно-эфирная смесь в соотношении 3/1.
4. Серный эфир.

Техника.

а) Общие белки. В широкую пробирку наливают 1 мл сыворотки, 3 мл буферного раствора (1) и 3–4 капли насыщенного раствора сульфата аммония (2), слегка встряхивают и помещают на 30 минут в кипящую водяную баню. Тем временем на аналитических весах уравновешиваются два количественных фильтра Шлейкер-Шюлля (диаметром 5–6 см). Фильтры вводятся один в другой и раствор фильтруется через двойной фильтр. Пробирку и фильтр промывают горячей водой до тех пор пока промывочная вода не перестает быть мутной (сульфат бария) при добавлении раствора гидрата бария 1%, что указывает на полное удаление сульфата аммония. После этого фильтр промывают спиртно-эфирной смесью (3) и эфиром (4). Оба фильтра высушивают в суцвдльном шкафу при 105–110° в течение часа, затем охлаждают в эксикаторе. Затем фильтр с осадком кладут на одну из чашек весов, а на другую кладут разновес до уравновешивания.Разница в весе (G) между обоими фильтрами дает общее количество белков на 1 мл сыворотки, следовательно:

Общие белки г/100 мл = G X 100.

б) Альбумины. В центрифужную пробирку отмеряют: 1 мл сыворотки, 2 мл дистиллированной воды и 3 мл насыщенного раствора сульфата аммония (2), слегка встряхивают и оставляют на 3 часа в термостате, при 37°, затем центрифугируют 15 минут при высокой скорости (3 500–4 ООО об/мин.) Из прозрачной надосадочной жидкости наливают 3 мл в широкую пробирку, добавляют 3 мл буфера (1) и вводят на 30 минут в кипящую водяную баню. Затем поступают так же как в случае общих белков: фильтрация, промывка, взвешивание.

Расчет. Разница в весе (G) между обоими фильтрами дает альбумины в 0,5 мл сыворотки. Следовательно:
Альбумины г/100 мл = G X 200.

в) Глобулины. Глобулины г/100 мл = общие белки – альбумины.

Метод с определением азота

Принципы. Основаны на определении азота методом Кьельдаля.

Метод включает следующие три определения:

1. Определение общего азота сыворотки. Смешивают 1 мл сыворотки с 30 мл изотопического раствора хлорида натрия и употребляют 2 мл смеси.
2. Определение небелкового азота сыворотки в фильтрате полученном после осаждения белков трихлоруксусной кислотой 20% (2 мл сыворотки, 6 мл дистиллированной воды, 2 мл трихлоруксусной кислоты 20%). Используют 5 мл фильтрата.
3. Определение азота альбуминовой фракции в фильтрате полученном после осаждения глобулинов сульфатом натрия 21,5% (1 мл сыворотки 30 мл сульфата натрия 21,5%; оставляют на 3 часа в термостате при 37 градусах перед фильтрованием). Употребляют 2 мл фильтрата.

Согласно методу Ховэ минерализация органического вещества (сыворотки и фильтрата) осуществляется 2 мл серной кислоты, 1 каплей сульфата меди 10% и 0,5 г сульфата калия.

После минерализации и дистилляции титруют едким натром 0,01 н., а при расчете учитывается, что 1 мл едкого натра 0,01 н. титрует 0,14 мг азота.

В результате этих определений подсчитывают:

Азот в общих белках = общий азот – небелковый азот.
Азот альбуминов = азот фильтрата после осаждения сульфатом натрия– небелковый азот.
Азот глобулинов = общий азот – азот фильтрата после осаждения сульфатом натрия.
Умножая таким образом полученные цифры азота на 6,25 получают общие белки, альбумины и глобулины.

Общие белки и белковые фракции

Принцип. Общие белки и белковые фракции осаждаются сульфитом натрия различной концентрации и определяются фотоколориметрически реакцией биурета, при использовании стандартной кривой, построенной с помощью сыворотки известной концентрации.

Реактивы.

1. Реактив биурета: а) Кристаллический сульфат меди 1,5%; б) едкий натр 30%. Приготовляют перед употреблением, смешивая 10 мл раствора а с 40 мл раствора б.
2. Безводный сульфит натрия 28%: растворяют 280 г безводного сульфита натрия или 560 г кристаллического сульфита натрия водного (Na8S047H20) в 950 мл дистиллированной воды при 80°. После растворения оставляют для охлаждения и объем дополняют до 1 ООО мл. Со временем из раствора на дно оседают кристаллы, которые растворяются при выдерживании бутылки в горячей водяной бане. Реактивы а, б и 2 сохраняют в закупоренных бутылках с парафинированными пробками.
3. Изотонический раствор хлорида натрия 0,9%.
4. Серный эфир.

Техника. Стандартная кривая строится следующим образом: к сыворотке содержащей количество общих белков, точно определенных гравиметрическим способом приливают изотонический раствор NaCl (3) до концентрации 3 г% общих белков. Затем приготовляют следующие разбавления:

а) 1 мл раствор белков 3% + 30 мл изотон. раствора NaCl
б) 6 мл раствор белков 3% + 25 мл изотон. раствора NaCl
в) 11 мл раствор белков 3% + 20 мл изотон. раствора NaCl

С этими растворами приготовляют серию в 15 разбавлений по следующей схеме:

1. 1 мл раствора а + 4 мл изотонического раствора NaCl
2. 2 мл раствора а + 3 мл изотонического раствора NaCl
3. 3 мл раствора а + 2 мл изотонического раствора NaCl
4. 4 мл раствора а + 1 мл изотонического раствора NaCl
5. 5 мл раствора а мл изотонического раствора NaCl
6. 1 мл раствора 6 + 4 мл изотонического раствора NaCl
7. 1 мл раствора 6+1 мл раствора а + 3 мл изотон раствора NaCl
8. 1 мл раствора 6 + 2 мл раствора а + 2 мл изотон. раствора NaCl
9. 1 мл раствора б + 3 мл раствора а + 1 мл изотон. раств. NaCl
10. 1 мл раствора б + 4 мл раствора а
11. 1 мл раствора в + 4 мл изотонического раствора NaCl
12. 1 мл раствора в + 1 мл раствора а + 3 мл изотон. раств. NaCl
13. 1 мл раствора в + 2 мл раствора а + 2 мл изотон. раств. NaCl
14. 1 мл раствора в + 3 мл раствора а + 1 мл изотон. раств. NaCl
15. 1 мл раствора в + 4 мл раствора.

Первое разбавление этой серии содержит 30/31 мг общих белков. Количество белков увеличивается на 30/31 для каждого разбавления, вплоть до последнего, которое содержит 450/31 мг.

К каждому из этих разбавлений добавляют по 5 мл биуретного реактива (1) и 2 мл эфира, затем слегка взбалтывают. Спустя 15 минут производится отсчет оптической плотности каждого разбавления на фотоколориметре Пульфриха с зеленым фильтром 530 мл, кюветой на 5 или 10 мм, и с таким образом полученными результатами строят стандартную кривую.

Осаждение. Берут 4 пронумерованных пробирки, причем в первую из них наливают 15 мл изотонического раствора NaCl, а в последующие, соответственно, по 15 мл; 11,3 мл и 8,8 мл раствора сульфита натрия 28%. (Если определяются только альбумины и глобулины то последние две пробирки отпадают). Объем пробирок 3 и 4 дополняется до 15 мл дистиллированной водой.

В пробирки 2, 3 и 4 добавляют по 0,5 исследуемой сыворотки, затем вводят в термостат при 37° и оставляют до следующего дня, когда фильтруют.

Определение. В момент определения добавляют 0,5 мл сыворотки в пробирку 1, а в другую серию из 4 пробирок берут в первую 5 мл таким образом разбавленной сыворотки, а в следующие 3 пробирки по 5 мл прозрачного фильтрата из прежних пробирок 2, 3 и 4. В других двух пробирках берут раздельно по 5 мл изотонического раствора NaCl в первую (слепой образец) и 5 мл сульфита натрия 28% – во вторую (контрольный образец для реактивов). В каждую из таким образом 6 приготовленных пробирок добавляют затем по 2 мл биуретового реактива (1) и 2 мл эфира (4) и затемслегка взбалтывают. Спустя 15 минут делают отсчет на фотоколориметре. Пульфриха в монохроматическом зеленом свете с фильтром 530 м (предположим, что Ej, Eg, Е3 и Е4 – оптические плотности образца находящегося в работе и Ев и Е – оптические плотности контрольного образцу и слепого образца реактивов.

Расчет. Общие белки г/100 мл = Ец – Еа.

Альбумины г/100 мл = Е2 – Ер.

Общие глобулины г/100 мл = общие белки – альбумины а-глобулины г/100 мл = Е3 – Е2 Р-глобулины г/100 мл = Е4 – Е3.

у-глобулины г/100 мл = общие глобулины – (а + (3).

Примечание: Окраска является устойчивой не более 1 часа.

Разбавления стандартной серии увеличиваются от одной до другой на 30/31 мг общих белков. Определения образца производят на 5/31 мл сыворотки, следовательно первое разбавление стандартной серии соответствует 0,6 г протеинов на 100 мл сыворотки, причем увеличение от одного разбавления до другого также составляет 0,6 г белков на 100 мл сыворотки. Последнее разбавление соответствует 9 г/100 мл, следовательно стандартная кривая дает содержание белков в сыворотке непосредственно в г/100 мл.

Примечание. Определение глобулиновых фракций  производится более точно электрофоретическим методом на бумаге.

Нормальные значения:
Общие белки 6,8–8 г/100 мл; а-глобулины 0,30–0,60 г/100 мл.
Общие альбумины 4,2–5,6 г/100 мл; (3-глобулины 0,55 –1,10' г/100 мл.
Общие глобулины 1,5 – 3 г/100 мл; у-глобулины 0,65 –1,30 г/100 мл.
Соотношение альбумины/глобулины: 1,6–2,5.

Патологические изменения. Общие белки увеличиваются при хронических инфекционных заболеваниях и снижаются при геморрагиях, нефрозах, анемиях, острых инфекциях, ревматизме 1 и истощении.
Глобулины увеличиваются при злокачественных опухолях, нефрозах, инфекциях, пневмонии.

Повышение глобулинов компенсируется снижением сывороточных альбуминов и наоборот. Соотношение альбумины /глобулины снижается в течение липоидного нефроза последовавшего за потерей альбумина через мочу. Кроме того соотношение снижается во время эдемов, при которых за счет компенсации вода инвадирует ткани, а также при асцитах.

Фибриноген

Гравиметрический метод

Принцип: Фибриноген осаждают хлористым кальцием, фильтруют, сушат и взвешивают.

Реактивы:

1. Лимонно-кислый натрий.
2. Хлористый кальций 0,125%, кристаллический, в изотоническом растворе NaCl.
3. Спирт.
4. Эфир.

Техника: Собирают 9 мл крови на 1 мл раствора лимонно-кислого натрия 3,6% (1). Смешивают легким переворачиванием пробирки 2–3 раза, центрифугируют 30 минут при 3 ООО об./мин. для отделения плазмы. 2 мл плазмы берут в пробирку для гемолиза (диаметром 6 мм) и добавляют 3 капли раствора хлористого кальция 5% (2), таким образом, чтобы этот последний попадал непосредственно в плазму, не стекаясь по стенкам пробирки.

Смешивают легким встряхиванием и переворачиванием пробирки несколько раз, после чего оставляют коагулировать фибрин в течение 30 минут в термостате при 37°С. С помощью пипетки Пастера сгусток фибрина отделяется со стенок пробирки и затем с помощью тонкой стеклянной палочки сплющенной на конце проталкивается на дно пробирки, таким образом, чтобы не закрывать весь ее просвет.

Полученная сыворотка сливается, промывается 2–3 раза дистиллированной водой, нажимая на сгусток стеклянной палочкой. Промывание повторяется по 2 раза, сначала спиртом (3), затем эфиром (4).

После промывания сгусток переводят либо на тарированный фильтр, либо на тарированное часовое стекло и высушивают при 105°С до постоянного веса, а затем взвешивают. Предположим, что G – вес осадка.

Расчет. Фибриноген мг/100 мл = GX.

Примечание. Недавно Гачев  предложил вариант этого метода: после осаждения хлористым кальцием растворяют в растворе едкого натра и определяют посредством реакции биурета.

Фибриноген можно определить и косвенно, дозируя общие белки в плазме и сыворотке. Разница представляет собой фибриноген.

Фотометрический метод

Принцип. Щелочные растворы фибрина дают комплекс окрашиваемый реактивом Фолен-Чокэлтэу, причем интенсивность окраски пропорциональна количеству содержащегося в образце фибриногена.

Реактивы.

1. Изотонический раствор NaCl 0,85%.
2. Тромбин.
3. Едкий натр 10%.
4. Кристаллический карбонат натрия 20%.
5. Реактив Фолен-Чокэлтэу.

Техника. В центрифужную пробирку с круглым дном берут щепотку толченного стекла пирекс, 10 мл изотонического раствора NaCl (1), 0,05 мл тромбина (2) и 0,5 мл плазмы полученной центрифугированием крови собранной на смеси оксалатов. Взбалтывают 2–3 минуты, вращая пробирку чтобы способствовать свертыванию фибриногена. По истечении 10 минут центрифугируют при 2.000 об/мин, затем сливают надосадочную жидкости и добавляют 10 мл изотонического раствора NaCl. Промывка изотоническим раствором NaCl повторяется два раза. После удаления промывочной жидкости, добавляют 1 мл едкого натра 10% (3) и подогревают в течение ю минут на водяной бане, закрывая пробирку воронкой, Охлаждают, добавляют 7 мл дистиллированной воды, 3 мл карбоната натрия 20% (4) и 1 MJ1 реактива Фолен-Чокэлтэу (5). По истечении 10 минут, 1 мл надосадочной жидкости разбавляют 3 мл дистиллированной воды и отсчитывается затухание по отношению к дистиллированной воде при 650 мц. с кюветой 10 мм Калибровку производят по отношению к раствору тирозина 200 мг°;/0& в соляной кислоте 0,1 н., принимая во внимание, что 1 мг тирозина соответствует 16,4 мг фибриногена /100 мл.

Примечание. Фотометрический метод является более точным, чем гравиметрический.

Физиопатологические изменения. Содержание фибриногена в нормальной крови колеблется в пределах 300–600 мг/100 мл, увеличиваясь главным образом в период менструации и беременности.

Фибриноген снижается при циррозах, кахексиях, анемиях, острых геморрагиях. Он увеличивается при гепатитах, в течение ряда инфекционных болезней (туберкулез, брюшной тиф), и сердечно-почечных заболеваниях, сопровождающихся отеками, а также при рентгенотерапии.

Ксантопротеиновая реакция

Принцип. В результате обработки горячей азотной кислотой в щелочной среде вещества с ароматическим ядром, находящиеся в крови, дают продукты нитрирования желтого цвета, сопоставляемые колориметрически со стандартным раствором бихромата калия.

Реактивы:

1. Трихлоруксусная кислота 20%.
2. Концентрированная азотная кислота (уд. вес = 1,40).
3. Едкий натр 33%.
4. Запасный раствор бихромата калия: взвешивают точно 0,3874 г бихромата калия для анализа, переводят в мерную колбу на 100 мл и дополняют до метки дистиллированной водой. Раствор сохраняют в коричневой бутылке, причем его устойчивость не изменяется во времени.

В момент употребления запасный раствор разбавляют 1/100 и получают стандартный раствор 3,87 мг%, который используют при колориметрировании.

Техника.

а) Дезальбуминирование. К 2 мл сыворотки добавляют равное количество трихлоруксусной кислоты 20% (1). Хорошо встряхивают и фильтруют.

б) Определение. К 2 мл прозрачного фильтрата добавляют 0,5 мл концентрированной азотной кислоты (2) и подогревают до кипячения в течение 30 секунд. После охлаждения под струей воды добавляют 1,5 мл едкого натра 33% (3). Если наблюдается слабая муть, фильтруют и затем объем дополняют до 4 мл. Сравнение производится на колориметре типа Дюбоска при дневном свете со стандартным раствором 3,87 мг%.

в) Результат. В случае нормальной деятельности почек, одинаковый цвет получается при значении контрольного образца, расположенном в пределах от 40 до 45. Если это значение необходимо понизить в пределах от 25 до 30 тогда существует легкая форма почечной недостаточности. Если окраска образца еще более яркая, это свидетельствует о более выраженной недостаточности, а если значение контрольного образца ниже 10, то речь идет о тяжелой почечной недостаточности.

Диагностическое значение. В крови вещества с ароматическим ядром увеличиваются главным образом при некоторых почечных заболеваниях, среди которых отмечаем: острые нефриты, выраженная олигурия.

Однако, ксантопротеиновая реакция имеет решающее значение при диагнозе уремии: подлинная уремия всегда сопровождается увеличением количества ароматических веществ в крови. Наконец, ксантопротеиновая реакция является положительной также при отравлении фенолом или после употребления больших количеств салициловых производных (пирамидон, аспирин и др.).

Примечания. Ароматические вещества распределены неравномерно между плазмой и кровяными шариками. Они скопляются в сыворотке, в связи с чем следует работать на сыворотке, а не на цельной крови, которая дает весьма заниженные результаты.