Определение энзиматической активности

Амилазная активность

Метод Вольгемута

Принцип. Гидролиз крахмала сывороточной амилазой. Определяется количество энзима, необходимое для гидролиза 2 мл раствора крахмала 1 «/оо в течение 30 минут при 37°.

Реактивы.

1. Изотонический раствор NaCl (0,9%).
2. Растворимый крахмал 1°/00 в изотоническом растворе NaCl. Применяют свежеприготовленный раствор.
3. Йод 0,1 н.

Техника. В 9 пробирках для гемолиза, пронумерованных от 1 до 9 берут по 1 мл изотонического раствора NaCl (1). В первую пробирку добавляют 1 мл сыворотки. Затем той же пипеткой берут 1 мл смеси из первой пробирки и переводят во вторую, хорошо споласкивая пипетку, после этого 1 мл переводят в третью и так далее, до последней пробирки, из которой выбрасывают 1 мл смеси. Таким образом получают следующую серию последовательных разбавлений сыворотки: 1/2; 1/4; 1/8; 1/16; 1/32; 1/64; 1/128; 1/256; 1/512.

Затем в каждую пробирку добавляют по 2 мл раствора крахмала (2), встряхивают и помещают в термостат при 37°. Спустя 30 минут пробирки вынимают и быстро охлаждают струей воды, затем в каждую добавляют по 1–3 капли раствора йода 0,1 н (3). Затем наблюдают и отмечают, в какой из них появляется сине-фиолетовая окраска крахмала. Это – первая пробирка, в которой крахмал не был гидролизирован амилазой.

Расчет. Амилазовая единица Вольгемута представляет собой количество энзима, необходимое для того чтобы гидролизировать 1 мл крахмала в течение 30 минут при 37°. Для расчета принимается во внимание последнее разбавление, в котором после добавления крахмала не появляется синий цвет. Результат получается в единицах Вольгемута, умножая степень разбавления на 2.

Пример. Синяя окраска появляется в пробирке № 5, что означает, что крахмал был гидролизирован до пробирки № 4 и следовательно, проба содержит 16 X 2 = 32 амилазовых единицы.

Фотометрический способ

Принцип. Оставшийся негидролизированным крахмал после энзиматической реакции дает с йодом синюю окраску, оптическая плотность которой определяется на фотоколориметре Пульфриха.

Реактивы.

1. Раствор 1,2% растворимого крахмального субстрата, приготовляемый непосредственно перед употреблением. Отвешивают 1,2 г aniylum solubile и взвешивают в 10 мл дистиллированной воды в мерной колбе на 100 мл. Доводят почти до метки горячей дистиллированной водой. Колбу погружают в кипящую водяную баню и добавляют до метки. Пламя удаляют, причем колбу оставляют в бане, которая в момент использования субстрата должна иметь температуру в 90°.
2. Буферный раствор фосфатов pH = 7,2. Растворяют 7,62 г однокалиевого фосфата и 20,45 г двухнатриевого фосфата в 1 000 мл дистиллированной воды в мерной колбе.
3. Раствор хлористого натрия 0,5 м.
4. Раствор соляной кислоты н.
5. Раствор йодо-йодистого калия: растворяют 30 г йодистого калия и 3 г йода в 1 000 мл дистиллированной воды в мерной колбе.

Техника. Берут 3 пробирки, меченные А, Б, В, причем в пробирки А и В вливают по 5 мл раствора субстрата (60 мг крахмала) при температуре 90°, 3 мл буферного раствора фосфатов (2) и 1 мл раствора хлористого натрия 0,5 м. В пробирке А произойдет энзиматическая реакция, а пробирка В служит для контроля. В пробирку Б, служащую для слепого образца берут 5 мл дистиллированной воды, 3 мл буферного раствора фосфатов и 1 мл хлористого натрия 0,5 м. Все три пробирки погружаются в водяную баню при 37° до тех пор, пока они не приобретают температуру бани. В пробирку А вливают 1 мл сыворотки и слегка встряхивают. Начиная с этого момента пробирки выдерживают в бане в течение 30 минут, после чего немедленно добавляют по 2 мл раствора соляной кислоты н (4), для прекращения энзиматической реакции.

В пробирки Б и В берут по 1 мл сыворотки или плазмы и осторожно встряхивают. В три мерные колбы на 500 мл также меченые А, Б, В, берут по 400 мл дистиллированной воды и 5 мл соляной кислоты и, затем добавляют по 2 мл смеси из соответствующей пробирки и по 1 мл йодного раствора (5) и доводят до метки дистиллированной водой. Тотчас же отсчитывается затухание синего раствора, соответствующая анализируемому образцу (Еа) и контрольному образцу (Ек) по отношению к слепому образцу на фотометре Пульфриха с фильтром на 620 м{х и кюветой на 1 см.

Согласно этому методу единицей амилазы является количество энзима, необходимого для гидролиза 10 мг крахмала при 37° в течение 30 минут. Метод характеризуется высокой чувствительностью и позволяет производить определение до 500 единиц амилазы /100 мл сыворотки. Для более высоких концентраций сыворотку или плазму необходимо разбавить в надлежащем соотношении.

Следует однако отметить, что недостатком метода является чрезмерный расход дистиллированной воды.
Соответственно этому методу нормальное значение равняется 50 амилазовых единиц/100 мл сыворотки.

Метод Хромецка-Эрлемана

Принцип. При рН=6,8 амилаза гидролизирует крахмал в моносахариды (глюкоза), которые дозируют методом Хагедорн-Иенсена.

Реактивы.

1. Фторид натрия, в порошке.
2. Стерильный изотонический раствор NaCl (0,85%).
3. Буферный раствор фосфатов pH 6,8. а) Однокалиевый фосфат м/15. Отвешивают 9,078 г однокалиевого фосфата «по Серенсену» и растворяют в 1000 мл в мерной колбе. б) двухнатриевый фосфат м/15. Отвешивают 11,876 г. двухнатриевого фосфата «по Серенсену» и растворяют в 1000 мл в мерной колбе Перед употреблением смешивают равные объемы растворов а и б.
4. Стерильный раствор крахмала 1%.
5.  Толуол.

Техника. Берут непосредственно из вены 1 мл крови в стерильную пробирку, содержащую 1 мг фтористого натрия (1). Энергично встряхивают. В другую стерильную пробирку берут 2,8 мл стерильного изотонического раствора NaCl (2) и добавляют 0,1 мл крови микропипеткой, всасывая и выдувая жидкость несколько раз в пробирку. Из этой смеси берут по 0,3 мл (0,01 мл сыворотки) в 2 стерильных пробирки, затем в каждую из них добавляют по 3 мл буферного фосфатного раствора pH =(3), 1 мл стерильного крахмала 1% (4) и одну каплю толуола (5). Из этой смеси берут 0,1 мл жидкости и тотчас же определяют восстановительную способность контрольного образца методом Хагедорн-Иенсена.

Затем обе пробирки выдерживают в термостате при 37° и по истечение 12 часов восстановительную способность определяют снова методом Хагердона.

Расчет. В таблице Хагердона значения глюкозы подсчитаны на 100 мл крови. Из среднего обнаруженного количества при титрировании обеих проб сначала вычитается значение полученное для контрольного образца. Так как для определения глюкозы используют 0,1 мл, то полученное значение следует делить на 1 000. Поскольку для определения амилазы берут только 0,01 мл крови, то для того чтобы выразить в мг глюкозы амилазовую активность, полученную в результате гидролиза крахмала энзимов, находящихся в 1 мл крови, таким образом полученный результат умножают на 100.

Пример. Для титрирования образцов израсходовано 1,46 мл тиосульфата 0,005 н., а для контрольного образца 1,90 мл тиосульфата 0,005 н. Этим значениям соответствуют следующие количества глюкозы: 1,46 = 96 мг/100 мл; 1,90=17 мг/100 мл. Вычитаем: 95–17=78 мг/100 мл. Деля на 1 000, получается 0,078 мг в 1 мл крови. Умножая на 100 получаем 7.8 мг/мл крови амилазовой активности.

Физиопатологические изменения. В нормальной крови амилазовая активность колеблется от 8 до 32 единиц Вольгемута или 7–8 мг/мл крови.

Пониженная амилазовая активность наблюдается при заболеваниях поджелудочной железы, желудка и двенадцатиперстной кишки. Амилазовая активность увеличивается при некоторых заболеваниях печени, желчного пузыря, а также при расстройствах почечных функций.

Липазная активность

Волюметрический метод

Принцип метода состоит в титрировании свободных жирных кислот раствором едкого натра 0,02 н. в присутствии фенолфталеина в качестве индикатора.

Реактивы.

1. Раствор нейтрального цитрата натрия 4%.
2. Чистый трибутирин.
3. Фтенолфталеин 0,12%.
4. Едкий натр 0,02 н.

Техника. К 5мл цитрата натрия 4% (1) добавляют 0,05 мл свежей сыворотки, встряхивают и погружают на 20 минут в водяную баню при 37°. Добавляют 0,2 мл трибутирина (2) энергично взбалтывают для эмульгирования трибутирина и оставляют на 3 часа в термостате при 37°. Охлаждают на льду добавляют 2 мл раствора фенолфталеина и титруют едким натром 0,02 н. (4) до появления бледно-розовой окраски.
Параллельно с этими операциями приготовляют также контрольный образец, в котором вместо сыворотки берут дистиллированную воду.

Расчет. Значение контрольного образца вычитают из значения анализируемого, а результат выражают в миллилитрах едкого натра 0,02 н.

По этому методу нормальное значение находится, в пределах от 3 до 5 мл едкого натра 0,02 н.

Сталагмометрический метод

Принцип. Жирная кислота, выделяемая энзиматическим гидролизом трибутирина изменяет поверхностное напряжение раствора. Поверхностное напряжение измеряют сталагмометрически, причем его изменение пропорционально гидролизированному количеству жира.

Реактивы.

1. Буферный фосфатный раствор pH = 8.
2. Насыщенный раствор чистого трибутирина: к 100 мл воды добавляют 8 мл буферного раствора pH 8 и 25 капель трибутирина. Смесь энергично перемешивают мешалкой непрерывного действия в течение одного часа. Раствор сохраняют не более четырех дней при + 4°.

Техника. В колбу на 50 мл берут 1 мл сыворотки, 8 мл насыщенного раствора трибутирина и 1 мл буферного раствора pH 8. Энергично встряхивают, переводят в сталагмометр и тотчас же определяют число капель. Остаток раствора сохраняют при 37°, причем отсчет капель повторяется по истечении 30 и 60 минут.

Расчет. Число капель относится к калибровочной кривой, определяемой соответственно указаниям, приведенным на стр. 434.

Липазная активность сокращается при тяжелых формах туберкулеза, кахексиях, отравлениях, расстройствах пищеварительного тракта у детей и др. и увеличивается при ожирении, разрушении жировой ткани, переломах костей, травматических поражениях мягких участков, начальной стадии туберкулеза и иногда при диабете и рахитизме.

Холинэстеразная активность

Метод Мишеля

Принцип метода основан на энзиматическом гидролизе ацетилхолина в уксусную кислоту, которую определяют титрованием едким натром 0,01 н.

Реактивы:

1. Ацетилхолин 1,5%.
2. Фенолфталеин 1%.
3. Едкий натр 0,01 н.

Техника. В две пробирки берут по 1 мл ацетилхолина 1,5% (1)} затем в первую пробирку добавляют 1 мл сывороткй, а во вторую; являющуюся контрольной, 1 мл сыворотки инактивированной в течение 30 минут при 56°С. В каждую пробирку добавляют по 2–3 капли фенолфталеина 1 % (2), титруют едким натром 0,0.1 н (3), вычитают значение контрольного образца из значения анализируемого а результат: выражают в миллилитрах едкого натра 0,01 н.

Нормальными значениями являются 2–4 мл едкого натра 0,01 й на 1 мл сыворотки. Холинэстераза крови состоит из двух энзимов: специфическая холинэстераза из эритроцитов и псевдохолинэстераза из плазмы.

При заболевании печени активность обеих холинэстераз снижается, возвращаясь к норме при функциональном восстановлении печени. Снижение активности холинэстеразы печени имеет место при механических желтухах вследствие каменной болезни, вследствие Чего ею нельзя пользоваться для дифференциального анализа желтухи. В подобных случаях, поскольку холинэстераза понижена или находится в норме при желтухе литиазного происхождения и повышена при желтухе, вызванной новообразованием хвоста поджелудочной железы, она сможет способствовать только установлению природы препятствия. Прогрессивное снижение холинэстеразы в течение гепатита и ее поддержания на низком уровне, свидетельствует о возникновении необратимых поражений.

Альдолазная активность

Принцип. Фосфорные триозы, получаемые в результате энзиматического гидролиза 1,6 дифосфата фруктозы, дают с 2,4-динитрофенил-гидразином продукт конденсации красного цвета с максимумом абсорбции при 530 мл.

Реактивы:

1. Коллидиновый раствор 0,1 н: добавляют 1,3 мл коллидина к 98,7 мл дистиллированной воды и доводят соляной кислотой  до pH 7,4.    Сульфат гидразина 6,5%. В мерной колбе на 100 мл растворяют 6 г вещества в 75 мл едкого натра 0,02 м, доводят до pH 7,4 и дополняют дистиллированной водой до метки.
2. Моно йодоуксусная кислота 0,002 м. После приготовления доводят едким натром до pH 7,4.3.    1,6-дифосфат фруктозы 0,02 м (натриевая соль). Растворяют 270 мг диофосфата фруктозы (бариева соль) в 8,5 мл соляной кислоты н и добавляют 1 мл сульфата натрия 14%. Центрифугируют для отделения осадка сульфата бария. Надосадочную жидкость переводят в мерную колбу на 25 мл, доводят до pH 7,4 едким натром н и дополняют дистиллированной водой до метки. Таким образом получают раствор 1,6- дифосфата фруктозы, который можно сохранять на льду в течение 2–3 недель.
3. Трихлоруксусная кислота 10%.
4. Едкий натр 0,02 н.
5. 2,4-динитрофенилгидразин 0,1% в соляной кислоте 2 н.

Техника. Применяют свежую сыворотку, или консервированную не более шести часов с момента взятия. В пробирки отмеченные О (образец) и К (контроль) берут 0,5 мл сыворотки, 0,5 мл коллидина (1) и 0,38 мл смеси, состоящей из равных частей сульфата гидразина (2), монойодоуксусной кислоты (3) и дистиллированной воды. В пробирку О добавляют 0,125 мл раствора натриевой соли 1,6-дифосфата фруктозы (4), встряхивают и оставляют на один час в термостате при 37°. По истечении этого промежутка времени в обе пробирки добавляют по 1,5 мл трихлоруксусной кислоты (5) и 0,125 мл 1,6-дифосфата фруктозы (4) только в пробирку К.

Фильтруют через количественную фильтровальную бумагу или центрифугируют. К 1 мл фильтрата добавляют по 1 мл едкого натра 0,02 н. (6), встряхивают и оставляют в покое на 10 минут при комнатной температуре. Затем добавляют по 1 мл 2,4-динитрофенилгидразина (7) и погружают на 10 минут в водяную баню при 37°.

Объем дополняют до 10 мл едким натром 0,02 н, и через 3 минуты производят фотометрический отсчет с зеленым фильтром на 530 мх. Отсчет затухания следует производить в промежуток времени, не превышающий 15 минут от момента окончания реакции.

Значение контрольного образца вычитают из значения анализируемого, а разницу умножают на 100. Нормальные значения колеблется в пределах от 3 до 7 ед./мл.

Альдолазовая активность значительно увеличивается при эпидемическом гепатите в течение первой недели болезни от 20 до 100 ед., а затем по мере развития болезни в сторону излечения постепенно снижается, доходя до нормальных значений.

Полипептидазная активность

Метод Ширге

Принцип. Сывороточная полипептидаза разлагает пептон в карбоксиловые группы, титруемые едким калием.

Реактивы:

1. Раствор пептона Витте 5%.
2. Толуол.
3. Спирт 96°.
4. Фенолфталеин 1%.
5. Едкий калий 0,01 н.

Техника. В две пробирки берут по 1 мл сыворотки и 1 мл пептона 5% (1). Легко встряхивают и добавляют 3–4 капли толуола (2) в первую пробирку, затем закупоривают пробкой и оставляют на 48 часов в термостате при 37°. Во вторую пробирку, используемую для контроля, тотчас же добавляют 18 мл спирта (3), хорошо встряхивают и спустя 30 минут фильтруют или центрифугируют. К 1 мл фильтрата добавляют 2 капли фенолфталеина 1% (4) и титруют едким калием 0,01 н. (5) до появления бледно-розовой устойчивой окраски.

Исследуемый образец вынимают из термостата, охлаждают, обрабатывают 18 мл спирта и фильтруют. К 12 мл фильтрата добавляют 2 капли фенолфталеина и титруют едким калием до появления бледно-красной окраски.

Расчет. Разница между количествами едкого калия, израсходованными для исследуемого и контрольного образцов дают полипептидазную активность 1 мл сыворотки.

По этому методу нормальное значение получается при 1–2,5 мл едкого калия 0,01 н.

Полипептидазная активность увеличивается при заболеваниях, печени, снижаясь до нормальных значений при выздоровлении. При поражении печени стертого характера, она повышена в 100% случаев, в то время как при некоторых циррозах, при которых значительные разрушения паренхимы уже не позволяют образование достаточных количеств энзима, она остается в норме. Полипептидазная активность увеличивается также при интенсивных метастазах печени, лейкемиях и при некоторых инфекционных болезнях.

Фосфатазная активность

Фосфатаза (или правильнее фосфатазная система) представляет собой энзимовый комплекс, гидролизирующий ряд сложных фосфорных эфиров, освобождая ортофосфорную кислоту.

В клинической биохимии сывороточный уровень фосфатазы определяют при оптимальном значении pH 8,6, то есть щелочную фосфатазу и при оптимальном значении pH 4,9 то есть кислую фосфатазу. Определение фосфатаземии основано на измерении количества ортофосфорной кислоты, выделяемой известным объемом сыворотки, воздействующей в стандартных условиях времени, pH, температуры и концентрации на субстрат (фосфорный сложный эфир): глицерофосфат натрия или монофенилфосфат натрия. Результаты этих определений выражают в фосфатных единицах.

Щелочная фосфатаза

Метод Боданского

Принцип. Определение фосфора в ортофосфорной кислоте выделяемой энзиматическим гидролизом (1-глицерофосфата натрия. Ортофосфорную кислоту определяют в контрольной сыворотке и в образце
сыворотки, оказавшем свое фосфатазное воздействие в течение 1 часа при 37°, pH = 8,6. Для определения фосфора применяют метод Белля, Дуази, Бриггса, видоизмененного Кутнером и Лихтенштейном.

Реактивы.

1. Субстрат: (глицерофосфат натрия в буферном растворе pH = 8,6. Отвешивают 0,5 г (3 -глицерофосфата натрия и 0,424 г натриевого веронала (диэтил-барбитурата натрия) и растворяют в 100 мл дистиллированной воды в мерной колбе. Раствор сохраняют на льду под толуолом или петролейным эфиром.
2. Трихлоруксусная кислота 10%.
3. Стандартный раствор однокалиевого фосфата. 110 мг однокалиевого фосфата для анализа по Серенсену, высушенного в эксикаторе, растворяют в 200 мл дистиллированной воды, добавляют 1 мл концентрированной серной кислоты и доводят до 250 мл в мерной колбе. 1 мл стандартного раствора содержит 0,1 мг фосфора. Из этого раствора приготовляют серию растворов для определения калибровочной кривой на фотометре Пульфриха (желтый фильтр на 530 мр). Для колориметрии приготовляют рабочий эталон, взяв 10 мл стандартного раствора и разбавляют до 300 мл: 6 мл разбавленного раствора содержат 0,02 мг фосфора.
4. Молибдено-серный реактив. а) Раствор молибдата натрия 7,5%. Растворяют 45 г чистой молибденовой кислоты в 125 мл едкого натра 5 н и дополняют до 1 000 дистиллированной водой. б) Раствор серной кислоты 10 н: 250 мл чистой концентрированной серной кислоты (уд. вес. = 1,84) разбавляют до 1 000 мл, затем титруют. В момент употребления смешивают, взбалтывая, равные объемы обоих растворов (а) и (б). Хорошо приготовленная смесь совершенно бесцветна.
5. Раствор хлористого олова 60%. Растворяют 15 г. хлористого олова в 25 мл концентрированной соляной кислоты. Раствор сохраняют на льду. В момент употребления берут 1 мл этого раствора и разбавляют до 400 мл дистиллированной водой. В промежутках времени между анализами, проводимыми в течение одного и того же дня, раствор сохраняют на льду.

Техника: а) Дезальбуминирование контрольного образца. К 1 мл сыворотки добавляют 10 мл раствора субстрата (1) и 9 мл трихлоруксусной кислоты 10% (2). Встряхивают, оставляют на несколько минут в покое и фильтруют.

б) Образец для энзиматического гидролиза. В пробирку с притертой пробкой берут 10 мл субстрата (1), погружают на несколько минут в водяную баню при 37°, затем добавляют 1 мл сыворотки пипеткой, конец которой держат над мениском растворе субстрата и перемешивают, не слишком сильно взбалтывая. Пробирку закупоривают, помещают в термостат или в водяную баню при 37° и выдерживают точно час. Затем тотчас же охлаждают водой со льдом, добавляют 9 мл трихлоруксусной кислоты 10%, встряхивают, оставляют в покое на несколько минут и фильтруют.

в) Определение фосфора. Берут 3 пробирки, в которые вводят: в первую – 6 мл прозрачного фильтрата из контрольного образца (0,3 мл сыворотки), во вторую – 6 мл фильтрата из образца для энзиматического гидролиза (0,3 мл сыворотки) и в третью – 6 мл стандартного раствора (3), разбавленного 10/300 (6 мл = 0,02 мг фосфора). В каждую пробирку добавляют по 2 мл молибденосерного реактива (4) и 2 мл раствора хлористого олова 60%, разбавленного 1/400, (5), осторожно пометит стеклянной палочкой при проведении этих операций. Получаемую желтую окраску сопоставляют спустя 10 минут и не более чем через 2 часа на колориметре Дюбоска или отсчитывают оптическую плотность на фотометре Пульфриха с желтым фильтром на 530мл и кюветой на 10 мм.

Фосфор, образуемый гидролизом мг/100 мл = фосфор после инкубации – фосфор в контрольном образце.

Примечания (по Луазелеру). Определения производят непосредственно после отделения сыворотки, а если это не представляется возможным, то материал можно сохранить на льду в течение нескольких часов. Для консервирования более продолжительное время добавляют 1 каплю толуола. Спустя 24–48 часов консервирования на льду фосфатазная активность увеличивается на 10–15%. При консервировании в течение того же промежутка времени при нормальной температуре (при отсылке образца почтой) получаются погрешности ± 20%, в основном приемлемые для необходимой клинической интерпретации результата.

Если фосфатазная активность весьма велика, то фильтрат разбавляют трихлоруксусной кислотой 10%, учитывая при расчете степень разбавления или продолжительность энзиматического воздействия сокращают до 30 или 15 минут, затем умножают полученные результаты соответственно на 1,8 или 3,3.

В тех же случаях образуемая ортофосфорная кислота, являясь сильным ингибитором энзимов, тормозит гидролиз субстрата. Для устранения этой погрешности Боданский рекомендует следующий прием: значение, полученное для минерального «фосфора», выделенного в результате эффекта фосфатазы, делят на 30, подсчитывают квадрат этого результата и затем добавляют к некорректированному значению.

Пример: 100 мл сыворотки выделили 60 мг фосфора: 60:30 = 2; 22 ==4; 60 + 4 = 64.

При гипофосфатаземиях может оказаться необходимым увеличение продолжительности инкубации до 2–3 часов. В этих условиях результат корректируют умножая соответственно на 0,55 или 0,39. Коррекция является абсолютно необходимой, принимая во внимание, что скорость энзиматической реакции постепенно снижается.

Трихлоруксусная кислота и (3-глицерофосфат натрия влияют на синюю окраску, претерпевающую помимо этого отклонения от колориметрического закона Ламберт-Беера. Практически все эти явления выражаются в погрешности 1,5% на 1 мл фильтрата.

Метод Дженнер-Кэй

Работают по методу Боданского, с той разницей, что вместо сыворотки используют обработанную оксалатом плазму, а инкубация в термостате продолжается 3 часа.

Метод Кинг-Армстронга

Принцип. Проводят энзиматический гидролиз монофенилфосфата натрия и колориметрическое определение выделенного фенола методом Фолин-Чокылтеу.

Реактивы:

1. Субстрат: двухнатриевый монофенилфосфат в буферном растворе pH = 9. Растворяют в 1000 мл в мерной колбе 1,09 г двухнатриевого монофенилфосфата (0,005 м) и 10,3 г натриевого веронала (0,05 м). Раствор сохраняют в течение одного месяца под хлороформом на льду в бутылке с притертой пробкой.
2. Реактив Фолин-Чокылтеу: в колбе на 2 000 мл, оснащенной обратным холодильником растворяют 100 г вольфрамата натрия и 25 г молибдата натрия в 700 мл дистиллированной воды. Добавляют 50 мл 85% фосфорной кислоты и 100 мл концентрированной соляной кислоты. Кипятят на умеренном пламени с орошением в течение 10 часов, затем добавляют 4 г сульфата лития и несколько капель брома и кипятят снова в течение 15 минут без холодильника, для удаления избыточного брома. Охлаждают, объем дополняют до 1 000 мл и фильтрует. Реактив не должен иметь бледносинего цвета, а должен быть желтым.
   В момент употребления один объем реактива разбавляют двумя объемами дистиллированной воды. Эталонный раствор фенола растворяют 1 г кристаллического фенола для анализа в соляной кислоте 0,1 и дополняют объем до 1 000 мл тем же реактивом. Точный титр фенола определяется йодометрически. В колбу с пробкой берут 25 мл раствора фенола 1% и добавляют 50 мл едкого натра 0,1 н. Нагревают до 50° и добавляют 25 мл раствора йода 1 н. Колбу закупоривают и оставляют в покое 30–40 минут после чего добавляют 5 мл концентрированной соляной кислоты и 1–2 капли раствора крахмала 1%, а избыток йода титруют раствором тиосульфата натрия 0,1 н. до исчезновения синей окраски.
   Каждый мл раствора йода 0,1 н, израсходованного фенолом соответствует 1,567 мг фенола. Раствор разбавляют таким образом, чтобы он содержал 1 мг фенола на мл. Реактив сохраняют неограниченное время в бутылке закупоренной притертой пробкой.
3. Из этого раствора берут 1 мл и разбавляют до 10 мл дистиллированной водой (1 мл раствора содержит 0,1 мг фенола). Раствор  сохраняют не более трех месяцев на льду в бутылке закупоренной притертой пробкой.
4. Кристаллический карбонат натрия 20%.

Техника: а) Энзиматический гидролиз субстрата. В пробирку с притертой пробкой берут 10 мл субстрата (1), нагревают 5 минут при 37° в водяной бане и добавляют 0,5 мл сыворотки. Встряхивают, выдерживают в течение 30 минут в термостате при 37°, добавляют 4–5 мл реактива Фолин-Чокылтеу, разбавленного 1/2 (2), и немедленно фильтруют.

б) Дезальбуминирование контрольного образца. К 0,5 мл сыворотки добавляют 10 мл субстрата (1) и 4,5 мл реактива Фолин- Чокэлтеу, разбавленного 1/2 (2). Встряхивают и тотчас же фильтруют.

в) Определение фенола. Берут 3 пробирки, причем в первую наливают 10 мл прозрачного фильтрата из образца для энзиматического гидролиза, во вторую – 10 мл фильтрата из контрольного образца и в третью– 10 мл стандартного раствора (4), разбавленного 1/10 (10мл =0,1 мг фенола).

В каждую пробирку добавляют по 2,5 мл раствора карбоната натрия 20% (5). Слегка встряхивают, причем пробирки выдерживают в течение 5 минут при 37° для проведения синей цветной реакции, затем окраски сопоставляются на колориметре Дюбоска или оптическая плотность отсчитывается на фотометре Пульфриха с желтым фильтром на 530 м(л и кюветой на 10 мм.

Фенол, образуемый гидролизом мг/100 мл = фенол после инкубации – фенол в контрольном образце.

Примечание (по Луазелеру). Если сыворотка богата фосфатазой, ее следует предварительно разбавить изотоническим раствором NaCl таким образом, чтобы смесь не содержала более 60 единиц на 100 мл. При расчетах результат умножают на степень разбавления. Двухнатриевый монофенилфосфат легче гидролизуется щелочной фосфатазой сыворотки, так что довольно точное определение фенола возможно даже тогда, когда сыворотка содержит весьма малое количество фосфатазы. Рекомендуется проводить два параллельных определения как для контрольного образца так и для образца, подвергаемого энзиматическому гидролизу.

По Боданскому единица фосфатазы (ед. Б) является количеством энзима в 100 мл сыворотки, необходимого для выделения 1 мг фосфора из глицерофосфата натрия в течение 1 часа при 37°, рН=8,6; таким образом количество мг фосфора, обнаруженного при определении, соответствует количеству ед. фосфатазы по Кэйю (ед. К) – это количество энзима в 100 мл плазмы, обработанной оксалатом, необходимое для выделения 1 мл фосфора из глицерофосфата натрия в течение 3 часов при 37°, pH = 8,6.

По Кинг-Армстронгу (ед. К. А.) единица фосфатазы – это количество энзима в 100 мл сыворотки, необходимое для выделения 1 мг фенола и двухнатриевого монофенилфосфата в течение 30 минут при 37°, pH 9. Следовательно, результаты полученные при применении вышеописанных способов несопоставимы между собой вследствие того, что единицы измерения фосфатазы, принятые авторами соответствующих методов, не имеют никакой общей меры. Поэтому можно сравнивать только результаты, полученные в строго одинаковых экспериментальных условиях (тот же способ).

По Боданскому нормальные значения колеблются в пределах от 5 до 15 ед. Б. у детей и от 2 до 4 взрослых.
По Кэйю, эти значения изменяются в зависимости от возраста.

По Кинг-Армстронгу, физиологические изменения щелочной фосфатазы находятся в пределах между 6–20 ед. К. А. у детей и 4–12 ед. К.А. у взрослых.

Щелочный фосфатаз увеличивается физиологически к концу беременности и в течение периода кормления грудью у женщин, а у ребенка – в течение периода интенсивной осификации (рост скелета). И наконец, гиперфосфатаземии наблюдаются также во время пищеварения вследствие интенсивной деятельности слизистой кишечника и печени, – органов со значительным содержанием фосфатазы.

Щелочная фосфатаза в значительной мере увеличивается при болезнях костей: фиброкистозный остеит Реклингаузена (20–40 ед.Б), деформирующий остеит Пажэ (от 30 и более 100 ед. Б,) рахитизм (умеренный, но ранний рост: 15–30 ед. Б или 30–50 ед. при тяжелой форме рахитизма), при раке (костные саркомы: 10–120 ед. Б.; костные метастазы рака 20–40 ед. Б.; некостный рак: 20–40 ед Б.), а также при желтухе, вследствие закупорки (20–40 ед. Б.), определение фосфатаза в данном случае являясь биохимическим способом дифференциального диагноза желтухи. И, наконец небольшие увеличения наблюдаются при лейкемиях - (10–30 ед. Б.) и базедовой болезни (10–15 ед. Б.)

Кислая фосфатаза

Метод Гутман-Гутмана

Принцип метода тот же, что и для определения щелочной фосфатазы по способу Кинг-Армстронга с той разницей, что энзиматический гидролиз двухнатриевого монофенилфосфата при 37° имеет место в кислой среде (рН=4,9). Определение фенола производят по вышеописанному способу.

Реактивы.

1. Субстрат в буферном растворе рН-4,9; растворяют 2,100 8 г лимонной кислоты для анализа в 20 мл едкого натра н., причем объем дополняют до 100 мл дистиллированной водой. Из полученного таким образом раствора нитрата натрия ОД берут 90 мл, добавляя 100 мл соляной кислоты 0,1 н. и 1,09 г двухнатриевого монофенилфосфата 0,005 ц и дополняют объем до 1 000 мл дистиллированной водой.
2. Остальные реактивы те же, что и применяемые при методе Кинг. Армстронга.

Техника. Поступают таким же образом как и при методе Кинг- Армстронга, лишь с той разницей, что энзиматический гидролиз сыворотки продолжается 1 час.

Примечание. Кислую фосфатазу можно определять и по способам, описанным Боданским и Дженер-Кэй, причем, однако, субстрат приготовляют в буферном растворе pH = 4,9.

Физиопатологические изменения. По Гутману (ед. р.  фосфатазной единицей является количество энзима в 100 мл сыворотки необходимое для выделения 1 мг фенола из двухнатриевого монофенилфосфата при 37°, рН=4,9 в течение 1 часа.

Нормальная сыворотка содержит весьма малые количества кислой фосфатазы, достигая 3 ед. г. у здорового ребенка и у взрослого.

«Кислая» фосфатаза увеличивается при раке предстательной железы, достигая 100 ед. г. в случаях сопровождающихся костными метастазами. В этих случаях щелочная фосфатаза остается в норме.

Трансаминазная активность

Принцип. Использование специфических субстратов дает возможность определять две трансаминазы: гипотамо-щавелевоуксусная трансаминаза (Щ) и глютамо-пировиноградная трансаминаза (ГПТ).

Энзиматические реакции происходят при 37° С в течение одного, часа. Эти реакций следующие:
(Щ)а-кетоглутаровая кислота + аспартиновая кислота = глутаминовая кислота + щавелевоуксусная кислота.
(ГПТ) а-кетоглутаровая кислота -f- аланин = глутаминовая кислота -V пировиноградная кислота.

Они прерываются цитратом анилина, который помимо этого декарбоксилирует щавелевоуксусную кислоту в пировиноградную. Эта последняя превращается в динитрофенилгидразон, дающий в щелочной среде красную окраску, пропорциональную количеству пировиноградной кислоты, присустствующей в анализируемом растворе.

Реактивы:

1. Субстрат Щ: в мерной колбе на 100 мл растворяют 2,66 г д.л.-аспартиновой кислоты и 2 г двухкалиевого фосфата в 80 мл дистиллированной воды при 80°, доводят до рН-7 едким натром н. Охлаждают, добавляют 0,030 г а-кетоглутаровой кислоты, доводят до pjj 7^4 и дополняют дистиллированной водой до метки.
2. Субстрат ГПТ. В мерной колбе на 100 мл растворяют 1,80 г д.л. аланина и 2 г двухкалиевого фосфата в 80 мл бидистиллированной воды. Доводят до pH 7, добавляют 0,030 г а-кетаглутаровой кислоты, доводят до pH 7,4, и дополняют бидистиллированной водой до метки. Растворы сохраняют на льду не более одного месяца, причем их можно использовать только, если они прозрачны.
3. Цитрат анилина. Растворяют 10 г лимонной кислоты в 10 мл дистиллированной воды. Перед употреблением смешивают с равным объемом чистого анилина.
4. Раствор 2,4-динитрофенилгидразина 0,20 г в 100 мл соляной кислоты н.
5. Раствор едкого натра 0,4 н.
6. Стандартный раствор пировиноградной кислоты. Растворяют 0, 220 мл пирувата натрия в 100 мл дистиллированной воды. Раствор сохраняют на льду не более одной недели. Перед употреблением разбавляют 1/10.

Техника. Для каждого определения приготовляют 4 пробирки (А, Б, В,Г) – А и В для образцов, а Б и Г для контрольных образцов. В пробирки А и Б берут по 1 мл субстрата Щ(1а), авБиГ – по 1мл субстрата ГПТ (16). Все пробирки погружают в водяную баню при 37°С на 5 минут. В пробирки А и В добавляют по 0,1 мл сыворотки и снова погружают на 1 час в водяную баню при 37°. В пробирки Б и Г добавляют по 0,1 мл цитрата анилина (2) и сильно встряхивают, затем приливают по 0,1 мл сыворотки, встряхивают и оставляют при комнатной температуре. Спустя 1 час пробирки Б и Г вынимают из бани, причем в каждую из них добавляют по 0,1 цитрата анилина (2). После этого во все пробирки приливают по 1 мл раствора 2,4-динитрофенилгидразина (3), хорошо встряхивают и спустя 6 минут добавляют по 10 мл едкого натра 0,4 н. (4).

Через 10 минут отсчитываются затухания по сравнению с контрольными образцами на фотометре Пульфриха с зеленым фильтром на 530 И кюветой на 20 мм и относятся к калибровочной кривой.

Для построения калибровочной кривой готовят 3 пробирки, в которые берут:
Номер пробирки    1    2    3
мл дистиллированной воды    т    ОД    0,1
мл субстрата Щ и ГПТ    1    0,85    0,70
мл пирувата натрия, разбавленного 1/10    . –    0,15    0,30
трансаминированный субстрат в /час    –    0,3    0,60

В каждую пробирку затем добавляют те же реактивы, как и в анализируемые образцы. Пробирка № 1 используется в качестве контрольной.

Для концентрации выше 0,6 лМ, закон Ламбер-Беера не соблюдается, так что сыворотки, трансаминазы которых имеют значения выше 0,6 цМ, необходимо разбавить 1/5. или 1/10.

Нормальные значения: 0,5–1,5 мг/мл для сыворотки.

Диагностическое значение. Повышенная трансаминаземия указывает на острый клеточный некроз, причем энзим поступает в кровообращение в результате расщепления богатых трансаминазой клеток.

Исследование сывороточной трансаминазы имеет значение, главным образом, при сердечно-сосудистых заболеваниях и болезнях печени. При инфаркте миокарда повышение начинается приблизительно через 6 часов после осложнения, достигая максимального уровня в пределах 24–48 часок и возвращается к норме между 5 и 7 днем, в случае, если болезнь протекаетнормально; наличие повышенных значений в течение продолжительно», промежутка времени указывает на угрожающий прогноз.

При токсических или инфекционных гепатитах за увеличением ГПТ следует постепенное снижение вплоть до нормализации параллели с фазами улучшения состояния больного. В большинстве случаев рецидив гепатитов сопровождаются вторичным повышением активности. Нормальное соотношение Щ/ГПТ имеет значение 1,33. Увеличение этого соотношения является характерным для инфаркта миокарда, в то время как при остром эппидемическом гепатите отмечаются снижения этого соотношения.

Менее значительное увеличение может иметь место также после длительного применения ряда гепатотоксических препаратов, как например, ларгактил, салицилаты, пиразинамид и др. Увеличение трансаминазы предшествует возникновению токсического гепатита, так что его определение дает возможность предвидеть появление этой формы гепатита у больных, получающих подобные препараты тем более, что значение трансаминазы возвращается к норме при прекращении медикаментозного лечения. Что касается инфекционного гепатита, следует отметить, что повышение Щ и ГПТ происходит за 2 или 3 недели до появления желтухи или других клинических симптомов. Таким образом определение Щ может оказать пользу в случае вспышки эпидемии для выявления контактных инфицированных лиц с целью их изолирования.

Увеличение сывороточной трансаминазы при раке печени является столь же чувствительным тестом как и щелочная фосфатаза, однако, в отличие от последней костные метастазы на нее не влияют.

Увеличение активной сывороточной трансаминазы можно наблюдать также при циррозах, закупорке желчных или панкреатических путей и остром суставном ревматизме.

Трансаминаземия дает нормальные значения при воспалении легких, хронических легочных заболеваниях, туберкулезе и др.

Каталазная активность

Метод Бах-Зубковой

Принцип: Перекись водорода, неразложенная кровяной каталазой, титруется перманганатом калия, согласно реакции:

КМп04 + 3HaS04 + 5НаОа = 2 MnSO* + KaS04 + 8НаО -f 50а

Реактивы.

1. Фосфатный буфер 0,1 м. pH == 6,8–7.
2. Перекись водорода 0,01 м. в фосфатном буфере.
3. Серная кислота 20%.
4. Перманганат калия ОД н.

Техника. В мерную колбу на 100 мл берут 0,1 мл собранной на гепарине крови, добавляют 1 мл дистиллированной воды для гемолиза И затем дополняют до метки фосфатным буфером (1). Из этого раствора 1 мл приливают в колбу, содержащую 20 мл раствора перекиси водорода 0,01 м. Параллельно в другую колбу, также содержащую 20 мл раствора перекиси водорода, 0,01 М, также приливают 1 мл анализируемого образца, разбавленного, но предварительно инактивированного в течение 10 минут при 100°С, являющегося контрольным образцом.

Обе колбы оставляют в ледяной бане на протяжении 30 минут, затем в каждую из них приливают по 10 мл серной кислоты 20% (3) для прекращения энзиматической реакции и подкисления среды. Образца титруют перманганатом калия 0,1 н. (4), причем значение контрольного образца вычитается из значения анализируемого.

Каталазная активность цельной крови по методу Бах-Зубковой выражается в процентах разложенной перекиси водорода.

Для нормальной сыворотки в вышеуказанных условиях каталазовая активность равняется 50%.

Активность кровяной каталазы снижается при заболеваниях печени в 82% случаев.