Определение липидных соединений в крови

Общий холестерин

Метод Григо

Принцип. Холестерин экстрагированный эфиром и растворенный в хлороформе дает реакцию Либермана: появление зеленой окраски под действием уксусного ангидрида и серной кислоты. Эта окраска, будучи пропорциональной концентрации холестерола сопоставляется с окраской одинаковым образом обрабатываемого стандартного раствора.

Реактивы.

1. Алкоголат натрия: растворяют 1 г едкого натра в 200 мл этилового спирта 60%.
2. Серный эфир.
3. Хлороформ для анализа или, в его отсутствии, ректифицированный хлороформ.
4. Уксусный ангидрид частый или ректифицированный.
5. Серная кислота (концентрированная) для анализа или чистая.
6. Стандартный раствор. Отвешивают 0,06 г холестерола высушенного при 105° и охлажденного в эксикаторе и растворяют в 100 мл хлороформ для анализа в мерной колбе: 1 мл – 0,6 мг холестерола. Раствор сохраняют на льду в хорошо закупоренной коричневой бутылке.

Техника.

а) Омыление. В разделительную воронку Григо (рис. 38) вводят 2 мл сыворотки и 13 мл алкоголата натрия (1). Пробку воронки хорошо закрывают и слегка встряхивают, переворачивая воронку 2–3 раза.

Рис. 38. Разделительная воронка Григо

б) Экстрагирование холестерола. Добавляют 15 мл эфира (2) и снова встряхивают. Вследствие омыления свободный и дезэфированный холестерол растворяются в эфире. Оставляют в покое в течение 10–20 минут для отделения эфирного слоя. Осторожно открывают кран воронки и оставляют стечь нижний водный слой. Затем кран закрывают, причем эфирный экстракт промывают два раза дистиллированной водой. Для этого добавляют 20 мл дистиллированной воды, так, чтобы она стекла по стенкам воронки, избегая таким образом эмульгирования эфирного экстракта. Слегка взбалтывают и затем оставляют в покое до тех пор пока оба слоя не разделятся совершенно четко. Воду удаляют и затем повторяют промывание. Эфирный экстракт переводят в фарфоровую чашечку на 50–60 мл, затем споласкивают дважды разделительную воронку 3–4 мл эфира, которые также собираются в чашечку. Чашечку помещают в электрическую водяную баню, которую подогревают до полного испарения эфира. Жирный осадок желто-коричневого цвета должен быть совершенно сухим, безводным для того, чтобы не препятствовать реакции Либермана.

в) Получение окраски. К осадку в чашечке добавляют 2 мл хлороформа (3) и смешивают тонкой стеклянной палочкой для того, чтобы ускорить растворение холестерола в хлороформе. Хлороформовый раствор переводят в пробирку, а чашечку тщательно споласкивают 3 мл хлороформа (следя затем, чтобы весь холестерол растворился), который собирается в ту же пробирку.

В другую пробирку наливают 5 мл стандартного раствора холестерола 0,06% (6), затем в обе пробирки добавляют по 2 мл уксусного ангидрида (4) и 5 капель концентрированной серной кислоты (5). Слегка встряхивают, пробирки закупоривают пробками и оставляют в покое в темном месте точно 30 минут, период в течение которого зеленая окраска достигает наибольшей интенсивности, после чего производят отсчет на колориметре Дюбоска.

Колориметрический отсчет анализируемого образца обработанного таким же образом можно производить и на фотоколориметре Пульфриха с красным фильтром на 720 мц и кюветой на 5 мм. Для расчета содержания холестерола пользуются стандартной кривой.

Примечания. При реакции Либермана появляется последовательно целый ряд различных окрасок: розовая, фиолетовая, синяя, зеленая и желто-бурая. Так как бурая окраска неприменима, то колориметрический отсчет следует производить для зеленой окраски, максимальная интенсивность которой наступает через 30 минут. Целый ряд факторов, среди которых наиболее существенным является чистота реактивов могут значительно изменить кинетику реакции.

Довольно часто к концу определения появляются различия оттенка окрасок обоих сравниваемых растворов. Эти различия имеют место вследствие того, что помимо холестерола реакцию Либермана дают также и другие стеролы (7-дигидрохолестерол, дегидроэпиандростерон и др.) имеющиеся в крови. Таким образом, необходимо сопоставлять окраску Либермана, происходящую из чистого холестерола (стандартный раствор) с окраской, которую дает смесь свободного холестерола, сложных эфиров холестерола и других стеролов (анализируемый раствор). Определение общего холестерола этим методом дает результаты удовлетворяющие клинические требования.

Микрометод с хлорным железом

Принцип: Хлорное железо, в уксусном растворе и в присутствии серной кислоты реагирует с холестеролом, давая красно-пурпурную окраску. Точная природа реакции неизвестна. По-видимому, имеет место дегидратация с окислением холестерола. Количество Fe, получаемого в результате реакции определяется колориметрически; оно пропорционально количеству холестерола.

Реактивы.

1. 0,05 % раствор хлорного железа для анализа в уксусной кислоте, обрабатываемой следующим образом: к 1 000 мл чистой уксусной кислоты добавляют 10 г хромового ангидрида (триокись хрома) и кипятят в течение 2 часов с орошением, затем дистиллируют, выбрасывая первую часть дистиллята (около 10%), а остальная часть используется для приготовления реактива.
2. Концентрированная серная кислота для анализа.
3. Стандартный раствор холестерола. Растворяют 100 мг чистого холестерола в 100 мл уксусной кислоты (обрабатываемой как указано выше) в мерной колбе.
4. Калибровочная кривая строится следующим образом: в мерную колбу на 100 мл наливают 4 мл стандартного раствора холестерола и доводят до метки раствором хлорного железа 0,05 % в уксусной кислоте. 5 мл раствора содержат 0,2 мг холестерола. Из этого раствора делают ряд разбавлений, содержащих соответственно 0,05; 0,075; 0,1; 0,125; 0,150; 0,175 и 0,20 мг холестерола в 5 мл раствора. 5 мл из каждого разбавления обрабатывают так же как и анализируемый образец и производят отсчет оптической плотности на фотоколориметре Пульфриха с кюветой на 10 мм и фильтром на 560 мл.

Техника. В центрифужную пробирку наливают 10 мл раствора хлорного железа 0,05% (1), добавляют 0,1 мл сыворотки, хорошо встряхивают и оставляют в покое на 10–15 минут, после чего центрифугируют. Берут две пробирки со шлифованной пробкой, причем в первую из них наливают 5 мл прозрачной надосадочной жидкости (0,05 мл крови), а во вторую служащую в качестве слепого образца – 5 мл 0,05% хлорного железа, в каждую пробирку добавляют по 3 мл концентрированной серной кислоты (2), Пробирки закупориваются пробками и хорошо взбалтываются посредством повторного переворачивания. Оставляют в темноте на 20–30 минут, затем затухание отсчитывается на фотометре Пульфриха.

Значение затухания относится к калибровочной кривой, причем результат получается в мг/100 мл.

Примечание. Этот микрометод обладает высокой чувствительностью и устраняет погрешности и трудности присущие классическому методу Григо.

Эстерифицированный и свободный холестерин

Метод осаждения свободного холестерола

Принцип. После отделения холестерола и сыворотки спиртноэфирной смесью, экстракт делят на 2 части; в первой части свободный холестерол осаждается дигитонином и сложный эфир холестерола определяется колориметрически, а во второй части – общий холестерол также колориметрически. Затем подсчитывается свободный холестерол в виде разницы.

Реактивы.

1. Спиртно-эфирная смесь: три объема перегнанного спирта + один объем перегнанного эфира.
2. Дигитонин 1%.
3. Хлороформ для анализа.
4. Реактивы (4), (5) и (6), применяемые при способе Григо, или реактивы, используемые для метода с хлорным железом.

Техника.

а) Экстрагирование холестерола. В мерную колбу на 25 мл наливают 15 мл спиртно-эфирной смеси (1), к которой добавляют по каплям 1 мл сыворотки, хорошо встряхивая после добавления каждой капли. Колбу ставят на одну минуту в кипящую водяную баню и хорошо перемешивают. Охлаждают, дополняют до метки спиртноэфирной смесью, затем фильтруют. Фильтрат собирают в бутылку, которую хорошо закупоривают; фильтрат служит для определения сложного эфира и общего холестерола.

б) Определение сложного эфира холестерола. В пробирку наливают 10 мл фильтрата (0,4 мл сыворотки) и нагревают на водяной бане до исчезновения запаха эфира. Затем добавляют 1 мл Дигитонина (2), слегка встряхивают и затем выпаривание продолжают на водяной бане до получения сухого осадка. Охлаждают и добавляют небольшими порциями хлороформ (3), встряхивая при каждом добавлении, затем фильтруют. Из фильтрата берут 5 мл (0,2 мл сыворотки), после чего сложный эфир холестерола определяется по вышеописанным способам.

в) Определение общего холестерола. В пробирку наливают 5 мл спиртно-эфирного фильтрата (0,2 мл сыворотки) и нагревают на водяной бане до полного выпаривания и получения сухого осадка. Охлаждают и добавляют небольшими порциями 10 мл хлорформа (3), каждый раз сильно встряхивая, затем фильтруют. Из фильтрата берут 5 мл (0,1 мл сыворотки) и определяют общий холестерол по вышеописанной технике Григо или способом с хлорным железом. Свободный холестерол мг/100 мл = общий холестерол – сложный эфир холестерола.

Микрометод без осаждения свободного холестерола

Принцип: кинетика реакции между холестеролом и хлорным железом зависит от температуры, а именно: при температуре 55–65° хлорное железо вступает в реакцию как со свободным холестеролом, так и со своими сложными эфирами, в то время как при 20° С в течение первых двух часов оно реагирует только со свободным холестеролом. По истечении этого промежутка времени, вступает в реакцию и сложный эфир холестерола. Таким образом, в различных температурных условиях становится возможным определение в одном и том же липидном экстракте как общего, так и свободного холестерола, причем расчет сложного эфира холестерола производится путем высчитывания разницы.

Реактивы.

1. Смесь спирт 90° – ацетон 1/2 объема.
2. Ректифицированный эфир.
3. Чистый хлороформ.
4. Уксусная кислота для анализа, свободная от окисляющих веществ.
5. Раствор чистого хлорного железа 1% в уксусной кислоте для анализа.
6. Серная кислота для анализа, уд. вес – 1,84, свободная от окисляющих веществ.
7. Смесь уксусной кислоты с серной кислотой 1:1 объемн.; серную кислоту осторожно добавляют к уксусной. Перед употреблением охлаждают.
8. Стандартный раствор холестерола: растворяют 50 мг холестерола в 100 мл уксусной кислоты для анализа. Раствор содержит 0,50 мг/мл.

Техника. В колбу 50 мл вводят 12 мл смеси спирта с ацетоном (1)    и 0,3 мл сыворотки. После встряхивания добавляют 6 мл эфира (2) и снова встряхивают. Фильтруют через количественный фильтр в фарфорровую или стеклянную чашку, покрывая воронку часовым стеклом. Колба и фильтр дважды ополаскиваются по 2 мл эфира, который собирают в ту же чашку. Выпаривают досуха при 55–60°С в электрическом сушильном шкафу или на водяной бане. После охлаждения осадок растворяют в 0,5 мл хлороформа (3), а затем тотчас же добавляют 1,9 мл уксусной кис- лоты (4). Хорошо смешивают, берут 2 пробирки диаметром 20 мл, соответственно отмеченные Т и L, 0,4 мл ацето-хлороформовой смеси (0,05 сыворотки) быстро влияют в пробирку Т и 0,8 мл липидного экстракт» (0,10 мл сыворотки) в пробирку L.

В пробирку Т (общий холестерол) наливают 2,4 мл уксусной кислоты (4) и 0,2 мл раствора хлорного железа (5). Хорошо встряхивают, затем мед» ленно добавляют 2 мл серной кислоты (6), так, чтобы она стекала по стенкам пробирки. Выжидают 2–3 минуты для того, чтобы серная кислота достигла дна пробирки, затем энергично встряхивают до тех пор, пока имеющий вид сиропа раствор не станет вполне однородным. В этих условиях смешение обеих кислот (уксусной и серной) вызывает повышение температуры до 65°С.

Оставляют на час в покое при температуре лаборатории для появления окраски, причем в течение этого времени смесь медленно охлаждается.

В пробирку L (свободный холестерол) добавляют 0,2 мл раствора хлорного железа (5) и 4 мл смеси уксусной кислоты с серной кислотой (7), охлажденной до температуры лаборатории, затем встряхивают как указано выше после чего пробирку помещают в водяную баню при 20°С, где оставляют на час, для появления окраски.

Для колориметрического отсчета одновременно с этими операциями в идентичных условиях, приготовляют два эталона, а именно: для общего холестерола: 0,2 мл стандартного раствора (8), 2,6 мл уксусной кислоты (4), 0,2 мл хлорного железа (5) и 2 мл концентрированной серной кислоты (6); для свободного холестерола: 0,2 мл стандартного раствора (8), 0,6 мл уксусной кислоты (4), 0,2 мл хлорного железа (5) и 4 мл смеси уксусной кислоты с серной кислотой (7).

В каждую пробирку добавляют по 0,2 мл раствора хлорного железа (5) и 2 мл серной кислоты (6) в тех же условиях как и для анализируемого образца. Количества стандартного раствора взятого для анализа соответствует 100, 200, 300 и 400 мг общего холестерола/100 мл.

Свободный холестерол:
мл стандартного раствора 0 0,1 0,2 0,3 0,4 мл уксусной кислоты    0,8 0,7 0,6 0,5 0,4

В каждую пробирку добавляют по 0,2 мл раствора хлорного железа (5) и 4 мл смеси уксусной кислоты с серной кислотой (7) в тех же условиях как и для анализируемого образца. Количества израсходованных мл стандартного раствора соответствуют 50, 100 150 и 200 мг свободного холестерола/100 мл.

Фотометрический отсчет производится ровно через 60 минут с кюветой на 10 мл и желтым фильтром на 570 мх, причем в качестве компенсаторной жидкости используется слепой образец.

Примечания. Микрометод менее сложен, более чувствителен и осуществляется быстрее, чем описанные классические методы определения общего, свободного и сложного эфира холестерола. Для получения точных результатов необходимо работать с уксусной и серной кислотами для анализа, не содержащими окисляющие вещества, которые могут вызвать побочное окисление пурпурного хромофора, снижая, таким образом, оптическую плотность.

Кроме того, рекомендуется как можно лучшая гомогенизация конечной смеси для того, чтобы кинетика цветной реакции соответствовала стандартным условиям поддержания температуры на уровне 20°С при определении свободного холестерола, а также колориметрический отсчет точно через 60 минут, как для свободного, так и для общего холестерола.

Биогенез и передвижение холестерола в организме

Холестерол в организме имеет двоякое происхождение: экзогенное и эндогенное. Экзогенный холестерол происходит из животных и растительных жиров, поглощаемых вместе с пищей. Взрослый человек употребляет ежедневно 400–500 мг холестерола. Эндогенный холестерол синтезируется паренхиматозными клетками печени. Клетки Куппфера не участвуют в обмене эндогенного холестерола, но играют существенную роль в обмене пищевого холестерола. В печени холестерол синтезируется из иона ацетата» или из более сложных молекул (некоторые жирные кислоты) в количестве 2 г в сутки, превышающем таким образом пищевой подвоз. Этот синтез в значительной мере замедляется, если режим питания богат холестеролом. Следовательно, регулирование холестерола зависит в большей мере от внутренних факторов, чем от пищевого подвоза. Холестерол в значительной мере распределяется равным образом между плазмой и кровяными шариками. Плазматический холестерол сочетается с фосфолипидами и глобулинами, образуя более или менее устойчивые ценапсы (Машбеф) и этерифицируется жирными кислотами (стеридами) в соотношении 2/3, а остальное количество находится в «свободном» неэтерифицированном состоянии. Глобулярный холестерол находится всецело в свободном состоянии.

Экзогенный холестерол животного происхождения поглощается на уровне кишечника в присутствии желчных кислот, оказывающих растворяющее действие и, совместно с эндогенным холестеролом, играет существенную роль в передвижении жирных кислот. Растительный холестерол не поглощается кишечником и выделяется как таковой вместе с фекальными материями. В кишечном просвете жирные кислоты, освобожденные в результате ферментационных процессов, связанных с пищеварением этерфицируются холестеролом, благодаря наличию энзима: панкреатический холестераз. Другая часть холестерола поступает в толстую кишку, где под действием кишечных бактерий превращается в копростерол и выделяется вместе с фекальными материями. Сложные эфиры холестерола поглощаются слизистой кишечника и гидролизируются на уровне кишечной клетки. Освобождаемая жирная кислота входит в состав фосфолипид который вместе со свободным холестеролом переходит в плазму, где в результате совместного действия холестеразы и плазматической лецитиназы происходит новая этерификация холестерола, способствующая передвижению кислот вплоть до печени и тканей. На уровне этих последних новый гидролиз выделяет жирную кислоту, благодаря чему становится возможным восстановление фосфолипида.

Таким образом, круговорот жирных кислот обеспечивается их попеременным соединением с холестеролом и глицерофосфорной кислотой.

Физиопатологические изменения. У здорового взрослого человека холестерол в крови изменяется в пределах от 140 до 200 мг/100 мл. Этот уровень увеличивается после поглощения более значительных количеств жиров. Физиологические изменения холестерола наблюдаются также в зависимости от возраста и физической деятельности человека. Располагаясь между 80 и 100 мг/100 мл при рождении, нормальный уровень холестерола в крови составляет 100 мг/100 мл у ребенка, достигая 140–200 мг/100 мл у взрослого. Часто у городских жителей и главным образом у лиц старше 40 лет, ведущих сидячий образ жизни, он увеличивается до 250 мг/100 мл. У стариков же холестерол снижается до 200 мг/100 мл. Легкие гиперхолестеролемии наблюдаются также в течение всего периода беременности.

Главным образом гиперхолестеролемии встречаются при: тяжелых инфекциях, в конечном периоде циррозов, кахексиях, болезни Аддисона, сердечных декомпенсациях, злокачественной анемии и гемолитической желтухе. Значительные гиперхолестеролемии наблюдаются при сахарном диабете сопровождая гипергликемию и являясь как и эта последняя столь же характерными для тяжести диабета.

Эти гиперхолестеролемии являются следствием ряда расстройств в обмене липидов, что ведет либо к синтезу более значительных количеств холестерола, исходя из избытка кетоновых веществ и уксусной кислоты, либо вызывая чрезмерное превращение запасных липидов в виде холестерола и фосфолипидов.

В результате лечения инсулином, холестерол резко снижается одновременно с гликемией. Прогноз является довольно тяжким, если в этих случаях снижается только гликемия. При диабете холестерол может достигнуть 1000 мг/100 мл, причем в этом случае кровяная сыворотка имеет бело-молочный вид.

Кроме того, гиперхолестеролемии встречаются также при: желтухе в результате закупорки желчных путей, когда при улучшении холестерол снижается медленнее билирубина, при липоидном нефрозе (главным образом сложный эфир холестерола), инфекционной желтухе, некоторых желчных литиазах, облитерирующем артериите, хроническом гломерулонефрите, вторичном почечном склерозе, артериальной гипертензии и др. Артериосклероз, главным образом старческий, довольно часто развивается не сопровождаясь повышением холестерола.

Соотношение свободный холестерол/сложный эфир холестерола = 1/2–1/3. Снижение этого соотношения является показателем недостаточности печени и наблюдается главным образом при тяжелых формах желтухи.