Определение небелковых азотных соединений в крови

Кроме крупных составных азотных молекул (белков) плазма содержит небольшие количества азотных веществ, представляющих собой перемещение метаболических элементов и дающих так называемый общий небелковый азот. Этот последний представлен: мочевиной, аммиаком, мочевой кислотой, креатином, креатинином, индиканом, аминокислотами и полипептидами.

Общий азот

Определяется методом Кьельдаля по технике описанной на странице 377, причем для минерализации используют 0,2–0,5 мл сыворотки.

Общий небелковый азот

Определяется методом Кьельдаля, по технике описанной на стр. 377, причем для минерализации применяют 5 мл фильтрата полученного после осаждения белков трихлоруксусной кислотой 20% (2 мл сыворотки 6 мл дистиллированной воды, 2 мл трихлоруксусной кислоты 20%).

Мочевина

Волюметрический метод с аппаратом Коварского

Принцип. Метод основан на разложении мочевины гипобромитостого натрия в щелочной среде. Происходящие реакции отличаются комплексным характером, причем в начале мочевина превращается в бромистое производное, в последующем подвергающееся гидролизу и окислению. В конечном итоге, реакция доходит до выделения азота (с промежуточным образованием целого ряда веществ: цианиды, нитрат, гидразин и др.) соответственно следующему общему уравнению:

CO(NH2)2 + 3NaOBr-+N2 + С02 + 3NaBr + 2НаО

В результате этой реакции получаются два газа: азот и углекислота. Эта последняя поглощается раствором и таким образом остается свободным только азот, объем которого измеряется.

Уреометр Коварского (рис. 37) состоит из изогнутой в виде буквы U стеклянной трубки, оснащенной на обеих ветвях (а и б) стеклянным краном. Кран г15 дает возможность отделить верхнюю часть трубки от остальной части. Верхняя часть трубки градуирована и служит для измерения исследуемой жидкости и добавляемых реактивов.

Рис. 37. Уреометр Коварского

Часть находящаяся над краном также градуирована и служит для измерения объема выделяющегося газа. Участок расположенный непосредственно под краном имеет меньший диаметр и градуирован на деления по 0,02 см8. Кран г2 – трехходовой, так что при его поворачивании можно получить 3 положения: 1) обе ветви трубки сообщаются между собой, а жидкость из боковой сточной трубки (с) не вытекает наружу; 2) обе ветви изолированы и жидкость из ветви (с) стекает наружу; з) обе ветви изолированы и жидкость из половины (Ь) не вытекает наружу.

Реактивы:

1. Трихлоруксусная кислота 10%.
2. Раствор Коварского: 150 г сульфата калия и 350 г хлористого натрия, растворяют при кипячении в 1000 мл воды, охлаждают и фильтруют.
3. Едкий натр 33%.
4. Бром (сохраняют под слоем дистиллированной воды в t–2 см).
5. Гипобромит натрия приготовляют перед употреблением, смешивая 6 мл едкого натра 33% с 12 каплями брома или если приготовляют более значительное количество, то их сохраняют на льду не более одной недели.

Примечание: Поскольку бром характеризуется высокой токсичностью, обращение с ним требует известных мер предосторожности. Для взятия брома необходимо пользоваться пипеткой, которую сначала вводят в слой воды, из которого всасывают около 1 мл и только после этого продолжают всасывать бром. Даже при этой мере предосторожности, предпочтительно не прибегать к непосредственному всасыванию, а лучше приспособить на конце пипетки резиновую грушу, причем гипобромит рекомендуется приготовлять под тягой или перед открытым окном.

Техника.

а) Дефекация. К 5 мл крови взятой на фториде или 2,5 мл сыворотки добавляют равный объем трихлоруксусной кислоты 10% (1),  хорошо встряхивают и центрифугируют или фильтруют через небольшой фильтр с диаметром в 4–5 см.

б) Разложение мочевины. Одновременно уреометр наполняют раствором Коварского (2). Для этого восстанавливают связь между разветвлениями аппарата с помощью крана г2, открывают кран гх и раствор наливают через небольшую воронку в разветвление (Ь) до тех пор, пока он не достигнет уровня немного выше крана гг. При наполнении аппарата необходимо, чтобы внутри его не осталось ни одного воздушного пузырька, особенно под краном г2, чего можно избергнуть слегка поворачивая кран в обе стороны. Кран г1 закрывают,  после чего находящуюся поверх его жидкость отсасы вают резиновой грушей, а затем трубку высушивают фильтровальной бумагой. Кран г2 открывают, таким образом восстанавливается связь между разветвлением (а) и боковой сточной трубкой.

Трихлоруксусный фильтрат вводят в трубку (а) и открывая кран г1з впускают точно 2,5 мл, после чего кран закрывают. Остальная жидкость отсасывается резиновой грушей, затем трубку дважды промывают 5–6 мл дистиллированной воды, воду выбрасывают, а трубку сушат фильтровальной бумагой. Раствор гипобромита натрия (5) вводят в трубку (а), внимательно открывают кран щ и быстро пропускают 5 мл. Затем кран закрывают. Процесс разложения мочевины начинается мгновенно. Ожидают 10–15 минут для полного выделения азота и для того, чтобы газ принял комнатную температуру.

Расчет: Для отсчета объема выделившегося азота поступают следующим образом: в ветвь (Ь) наливают раствор Коварского до выравнивания уровня жидкости находящейся в ветви (а). Если уровень раствора Коварского в трубке (Ь) выше, то кран га располагают так, чтобы из этой части трубки стекло столько жидкости, сколько необходимо для того, чтобы в момент установления сообщения между обеими ветвями трубки получить одинаковый уровень.

Отсчитывается объем выделившегося газа, температура лаборатории и атмосферное давление (Н), после чего в таблице XXIX находят соответствующий температуре и давлению фактор, который умножают на объем выделившегося азота.

Пример: предположим, что отсчет дал 0,19 см2 азота при 20° и 755 мм. Для 20° и 755 мм в таблице находим фактор 1,95.

Следовательно: мочевина мг/100 мл = 0,19 X 1,95 X 100. При отсутствии барометра, обычно отсчитанный объем азота умножается на 2.

Примечания: Если работали с 5 мл трихлоруксусного фильтрата вместо 2,5 мл, то результат следует разделить на 2, а если использовали только 1,25 мл трихлоруксусного фильтрата, то результат необходимо умножить на 2.

Благодаря своей значительной диффузионной способности, мочевина равномерно распределена между плазмой и кровяными тельцами.

Молекула стрептомицина содержит 2 гуанидиновые группы, которые также разлагаются гипобромитом натрия с выделением азота. Поэтому, флаконы со стрептомицином или шприцы использованные для впрыскивания этого антибиотика могут быть применены для взятия крови лишь только после их тщательной предварительной промывки, во избежание получения ошибочных результатов, вследствие погрешностей возникающих при операции сбора крови.

Метод с аппаратом Ван-Слайка

Принцип определения тот же, что и для метода Коварского.

Реактивы:

1. Трихлоруксусная кислота 10%.
2. Едкий натр 20%.
3. Гипобромит натрия: непосредственно перед употреблением смешивают 10 мл едкого натра 40% с 0,2 мл брома. Смесь взбалтывают под струей воды.

Техника:

а) Дефекация. В пробирку наливают 3 мл сыворотки, плазмы или цельной крови и 9 мл трихлоруксусной кислоты 10% (1). Хорошо взбалтывают и фильтруют. Фильтрат должен быть прозрачным.

б) Разложение мочи. Аппарат Ван Слайка (см. рис. 49), наполняют ртутью. Для этого оба крана открываются, а резервуар со ртутью слегка поднимают, до тех пор пока небольшое количество ртути попадет в воронку аппарата. Закрывают кран г2 и в воронку аппарата вводят 5 мл точно замеренного фильтрата. Открывают кран г2 и опуская резервуар со ртутью впускают фильтрат в аппарат, избегая проникновения воздушных пузырьков. Кран г2 закрывают и, как указано выше, вводят последовательно в аппарат 4 мл едкого натра 20% (2) и 1 мл гипобромита натрия (3). Кран г1 закрывают, а кран г2 открывают. Ртуть опускается до метки 50 аппарата в результате соответствующего понижения резервуара, затем кран г2 закрывают. Хорошо взбалтывают, переворачивая аппарат 10–15 раз, таким образом, чтобы выделение азота было полным.

Кран г2 открывают и затем ртуть снова вводят в аппарат, таким образом, чтобы ртуть в резервуаре находилась на том же уровне, что и ртуть в колонне аппарата Ван Слайка. Отсчитываются объем выделенного азота, температура лаборатории и атмосферное давление.

Расчет. Мочевина мг/100 мл = V х/ X 100, где:
V    – объем выделенного азота;
X – фактор из таблицы Коварского.

Примечания. Для проведения нового определения жидкость из аппарата удаляется через боковой штуцер крана гх. После нескольких определений аппарат следует промыть дистиллированной водой.

Волюметрические методы менее точны, так как гипобромит натрия выделяет также азот из аммиака и аминокислот в связи с чем получаются несколько повышенные результата.

Гравиметрический метод с ксантгидролом

Принцип. Мочевина осаждается ксантгидролом в виде нерастворимой диксантил-мочевины по известному уравнению.

Таким образом осажденная диксантил-мочевина отделяется, высушивается и взвешивается, а при проведении расчетов принимается во внимание, что ее вес в 7 раз больше веса мочевины.

Реактивы.

1. Реактив Танре: взвешивают 2,71 г хлористой ртути для анализа и 7,2 г йодистого калия; смешивают с 66,6 мл ледяной уксусной кислоты и дополняют до 100 мл дистиллированной водой.
2. Ледяная уксусная кислота.
3. Ксантгидрол 10% в чистом метиловом спирте. Приготовляется непосредственно перед употреблением, так как спустя несколько часов имеет место гидролиз ксантгидрола.
4. Абсолютный метиловый спирт.

Texника.

а) Дефекация. Берут 5 мл сыворотки и 5 мл реактива Танре (1). Слегка встряхивают и фильтруют через 5 минут.

Осаждение мочевины. К 5 мл прозрачного фильтрата (2,5 мл сыворотки) добавляют 5 мл ледяной уксусной кислоты (2) и 1 мд прозрачного раствора ксантгидрола 10% (3). Ксантгидрол добавляют в виде 3 порций с 10-минутными перерывами. Оставляют в покое на 3 часа. Уравновешивают на аналитических весах два количественных фильтра диаметром 5–6 см. Фильтры гофрируют и затем кладут один на другой. Жидкость фильтруют на двойном фильтре. Пробирку и осадок промывают 3–4 раза абсолютным метиловым спиртом (4), так как водный метиловый спирт растворяет диксантилмочевину. Оба фильтра высушивают при 105° в течение 1 часа и охлаждают в эксикаторе. Взвешивают на аналитических весах, причем фильтр с осадком кладут на одну из чаш, а другой (тару) на противоположную чашу. Разница в весе между обоими фильтрами представляет собой диксантилмочевину.

Примечания. Поскольку ксантгидрол растворяется в метиловом спирте, метод исключает предварительную операцию приготовления ксантгидрола, необходимую при способах рекомендующих его растворение в воде.
Концентрация используемого при осаждении ксантгидрола вдвое больше концентрации указываемой классическими способами. Эта предосторожность необходима во избежание получения завышенных результатов по сравнению с фактическими.

Погрешность результатов этого метода равна ± 1% до концентрации 200 мг мочевины /100 мл. Для того, чтобы сохранить ту же чувствительность метода, сыворотки с большим содержанием мочевины необходимо разбавить.

Физиопатологические изменения. В нормальных условиях мочевина колеблется в пределах от 20 до 50 мг/100 мл по волюметрическим методам и от 20 до 40 мг/100 мл по гравиметрическому методу.

Если мочевина не слишком повышена, то есть более 75 мг/100 мл или даже более 100 мг/100 мл, отдельное определение мочевины в крови имеет лишь небольшую ценность, как для утверждения, так и для отрицания почечной недостаточности.

В подобных случаях результаты этого определения следует учитывать только в свете более полного функционального обследования.

Ж. Гамбурже и Н. Массон, наблюдая за 150 больными, установили, что тот или иной больной может иметь нормальный клиренс на действие манитола (более 100 мл/мин), указывая на удовлетворительную клубочковую функцию и все же у этого больного мочевина в крови может превышать 50 мг/100 мл. Наоборот, концентрация мочевины может оставаться в нормальных пределах, в то время как клиренс на действие манитола спадает наполовину и, следовательно, функциональная утрата достигает 50% физиологической активности. Вообще, для значений экскреторной способности, расположенных в пределах от 100 до 50% нормального значении, концентрация мочевины в крови не имеет никакого количественного значении для выражения тяжести нарушения почечной функции. Для того, чтобы концентрация мочевины в крови была выше нормы у всех больных, необходима почечная недостаточность, пониженная по меньшей мере на 2/3 клубочкового клиренса.

Видаль и П. Валлери-Радо утверждают, что азотемия может иметь двойственное значение для концентрации находящихся в пределах от 50 до 100 мг/100 мл и что определения следует повторить, учитывая возможность случайных повышений уровня мочевины. Таким образом, определение мочевины может находиться под влиянием содержания белков в пище, а также зависит от объема диуреза. Поэтому до проведения анализа больной должен находиться в течение 2–3 дней на слабо азотированном и дехлорированном режиме, а взятие крови должно производиться натощак. Мочевина в крови снижается при липоидном нефрозе, острой печеночной недостаточности (желтой атрофии, отравлениях фосфором, мышьяком, четыреххлористым углеродом и др.).

Азотемия увеличивается при: хронических нефритах, острых нефритах, ряде инфекционных и сердечных болезней и т.д.

Мочевая кислота

Фотометрический метод

Принцип. Мочевая кислота восстанавливает фосфорновольфрамовый реактив, давая синюю окраску, пропорциональную ее концентрации в анализируемом образце. Эта окраска сопоставляется с окраской стандартного раствора мочевой кислоты, обработанного в одинаковых условиях.

Реактивы.

1. Ацетат урана 1,55%.
2. Фосфорновольфрамовый реактив: смешивают 50 г вольфрамата натрия и 40 мл фосфорной кислоты 85% (уд. вес 1,71) с 350 мл дистиллированной воды в колбе на 1000 мл с обратным холодильником и кипятят не менее 2 часов. После охлаждения, объем доводят дистиллированной водой до 500 мл. Если реактив зеленый, добавляют 1–2 капли брома и кипятят в течение нескольких минут без холодильника. Реактив имеет бледный желтовато-зеленый цвет и сохраняется в коричневой бутылке неопределенный срок.
3. Карбонат натрия 22% кристаллический.

Техника.

а) Дефекация. К 4 мл сыворотки добавляют 4 мл ацетата урана 1,55% (1) и 12 мл дистиллированной воды. Тщательно взбалтывают и фильтруют через небольшой гофрированный фильтр.

б) Восстановление фосфорновольфрамового реактива. К прозрачному фильтрату добавляют 0,4 мл фосфорновольфрамового реактива (2) и 3,6 мл карбоната натрия 22% (3). Спустя 8–20минут отсчитывается затухание на фотометре Пульфриха с кюветой 20 с фильтром 570 Mfi или 610 мх, используя для контроля дистиллированную воду.

Расчет: для фильтра 570 мх: мочевая кислота мг/100 мл равняется 9,49.    
Для фильтра 610 мл: мочевая кислота мг/100 мл = Е х 6,86.

Примечания. Для отсчета на фотометре можно пользоваться также стандартной кривой, построенной со шкалой стандартных растворов мочевой кислоты, приготовленных как будет указано ниже и обработанных так же, как и анализируемый образец.

Если не располагают достаточным количеством сыворотки, можно работать и с 2 мл. В этих условиях берут половинное количество реактивов. Конечный объем синего раствора достаточен для того, чтобы заполнить кювету в 20 мм; однако если он все же мал, то колориметрирование проводится в кювете на 10 мм, а результат умножают на 2.

Колориметрический метод

Принцип: Тот же, что и для предыдущего метода.

Реактивы:

1. Вольфрамат натрия 10%. 2). Серная кислота 2/3 н.
2. Карбонат натрия 40%, кристаллический. 
3. Фосфорновольфрамовый реактив. Смешивают 10 мл вольфрамата натрия 10%, 80 мл фосфорной кислоты 85% и 750 мл дистиллированной воды. Кипятят не менее 2 часов с обратным холодильником. После охлаждения объем дополняют до 1000мл и затем фильтруют.
4. Мочевая кислота, стандартный раствор. Приготовляется смешивая 0,2 г мочевой кислоты, 2 г двунатриевого фосфата и 1 г мононатриевого фосфата с 600 мл теплой дистиллированной воды (60°) в мерной колбе на 1000 мл. Колбу помещают в водяную баню и встряхивают до полного растворения. После охлаждения, дополняют до метки. 1 мл стандартного раствора = 0,5 мг мочевой кислоты.

Стандартный раствор может храниться в течение нескольких месяцев на льду в небольших флаконах, герметически закупоренных парафинированием, после добавления нескольких капель хлороформа.

Перед употреблением приготовляют рабочий стандарт, разбавляя запасный раствор 1/2:1 мл рабочего стандартного раствора содержит 0,1 мг мочевой кислоты.

Техника.  Дезальбуминирование. К 4мл сыворотки или плазмы добавляют 4 мл вольфрамата натрия 10% (1), 28 мл дистиллированной воды и 4 мл серной кислоты 2/3 н. Хорошо встряхивают и через несколько минут фильтруют. Фильтрат должен быть прозрачным.

Определение. В мерную колбу на 25 мл берут: 20 мл фильтрата (2 мл сыворотки), 1,5 мл карбоната натрия 40% (3) и 0,5 мл фосфор- новольфрамового реактива (4). Параллельно приготовляют стандартный раствор, используя и на этот раз мерную колбу на 25 мл, в которую к рабочему стандартному раствору (0,1 мг мочевой кислоты) добавляют 1,5 мл карбоната натрия 40% (3) и 0,5 мл фосфорновольфрамого реактива (4). Объем обеих таким образом приготовленных колб дополняют до метки дистиллированной водой, а по истечении 10 минут производят отсчет на колориметре типа Дюбоска.

Расчет. Мочевая кислота мг/100 мл =высота анализируемого раствораX 0,1 X 50.

Примечания. За 2–3 дня до проведения анализа больной должен соблюдать молочно-вегетарианский режим, избегая мясо, жиры и т.д.

Взятие крови не производят на оксалате натрия или калия (2 мг/мл крови), так как этот последний дает осадки с реактивами, используемыми при определении мочевой кислоты. По этой причине рекомендуется применение оксалата лития (1 мг/мл крови), которое в случае отсутствия приготовляется следующим образом:

В сосуд в 3 л к 85 г щавелевой кислоты и 50 г карбоната лития добавляют 1 л горячей воды (70°). Взбалтывают до полного растворения, фильтруют и выпаривают досуха.

Физиопатологические изменения. В нормальных условиях урицемия колеблется в пределах от 2 до 5 мг/100 мл.

Мочевая кислота может быть как экзогенного происхождения (продукты питания), так и эндогенного. Являясь конечным продуктом обмена нуклеопротеинов, богатые нуклеопротеинами продукты вызывают рост урицемии.

Урицемия увеличивается в первую очередь при болезнях характеризующихся нарушением обмена пуриновых оснований (подагра, артритизм). Повышенные значения наблюдаются также при некоторых почечных заболеваниях: острые или подострые нефриты, туберкулез почек, пионефроз, гидронефроз, олигурии, анурии и др. И наконец, урицемия может увеличиваться также при эклампсиях, сердечных декомпенсациях, отравлениях свинцом и при некоторых болезнях крови: лейкемиях, злокачественных анемиях и др.

Креатинин

Принцип. В сильно щелочной среде креатинин восстанавливает пикриновую кислоту в пикраминовую кислоту красно-оранжевого цвета (реакция Яффе), которую сопоставляют колориметрически с эталоном креатинина.

Реактивы.

1. Вольфрамат натрия 10%.
2. Серная кислота 2/3 н.
3. Насыщенный раствор (1,2%) очищенной пикриновой кислоты. Растворяют в бензоле и последовательно перекристаллизуют несколько раз.
4. Едкий натр (10%).
5. Пикрат натрия: непосредственно перед употреблением смешивают 5 объемов насыщенного раствора пикриновой кислоты (3), с 1 объемом раствора едкого натра 10% (4).
6. Запасный раствор креатинина: в мерной колбе на 100 мл растворяй 100 мг креатинина или 161 мг хлористого цинка-кератинина (C4H7N80) ZnCl8 в 5 мл дистиллированной воды и 10 мл соляной кислоты и. и дополняют до метки дистиллированной Водой1 мл запасного раствора креатинина.

В момент употребления приготовляют рабочий стандартный раствор разбавляя запасный раствор 1/100. 1 мл рабочего стандарта содержит 0,01 мг креатинина.

Техника. а) Дезальбуминирование. Наливают 2 мл сыворотки, плазмы или крови собранной на оксалате, 14 мл дистиллированной воды, 2 мл вольфрамата натрия 10% (1) и 2 мл серной кислоты 2/3 н. Хорошо взбалтывают и фильтруют.

б) Определение. К 10 мл прозрачного фильтрата (1 мл сыворотки) добавляют 5 мл пикрата натрия (5). Одновременно в другую пробирку вливают 2 мл рабочего стандарта (0,02 мг креатинина), затем добавляют 5 мл пикрата натрия (5) и 8 мл дистиллированной воды. Слегка взбалтывают и по истечении 10 минут производят отсчет на колориметре типа Дюбоска.

Примечание: отсчет необходимо производить не позже 15 минут с момента добавления пикрата натрия.

Метод Поппера

Реактивы:

1. Очищенная пикриновая кислота, насыщенный раствор (1,2%).
2. Едкий натр 10%.

Техника: К 12 мл насыщенного раствора пикриновой кислоты (1) добавляют 4 мл сыворотки или плазмы по каплям, взбалтывая непрерывно. Пробирку на 10–15 секунд вводят в кипящую водяную баню, затем тотчас же фильтруют через количественный фильтр. После охлаждения берут 10 мл прозрачного фильтрата и добавляют 0,5 мл раствора едкого натра 10% (2). Если раствор непрозрачный, его фильтруют, а через 20 минут производится отсчет на фотометре с фильтром 530 MJX и кюветой в 20 мм. Стандартная кривая устанавливается с помощью шкалы стандартных растворов креатинина содержащих 0,5; 1; 1,5; 2; 2,5; 3 и 5 мг креатинина, обрабатываемых таким же образом, как и анализируемый образец.

Примечания. Реакция Яффе неспецифична для креатинина, поскольку ее дают также и другие содержащиеся в крови вещества (глюкоза и др).

В отсутствии креатинина можно пользоваться стандартным раствором бихромата калия 0,5 н., окраска которого эквивалентна окраске 2 мг/100 мл раствора креатинина.

Хлористый цинк – креатинин можно приготовить из мочи следующим образом (по Ж. Луазелер) : к 500 мл мочи добавляют до прекращений осаждения смесь состоящую из 1 объема насыщенного раствора нитрата бария и 2 объемов насыщенного раствора гидрата бария. Оставляют в покое, фильтруют и выпаривают до паточной консистенции, затем добавляют равный объем абсолютного спирта, хорошо смешивают, после чего добавляют 1 мл насыщенного спиртного раствора хлористого цинка, закрывают и оставляют на 2 дня. Разделяют фильтрацией таким образом полученные кристаллы, затем их промывают абсолютным спиртом. Кристаллы хлористого цинк-креатинина растворяют в 200 мл воды, кипятят с животным углем, фильтруют, концентрируют и. оставляют на кристаллизацию. Кристаллы выделенные фильтрацией и сушкой используются для приготовления стандартного раствора.

Для того, чтобы избежать сильного разбавления плазмы дающей концентрацию креатинина в фильтрате примерно в 0,1 мг/100 мл, снижая таким образом чувствительность метода. Берхин предлагает осаждение плазматических белков трихлоруксусной кислотой и нейтрализацию избытка кислоты едким натром.

Метод Поппера также исключает это неудобство, являясь, следовательно, более чувствительным, чем метод Фолена.

Креатин + креатинин

Принцип. Путем гидролиза соляной кислотой креатин переходит в его ангидрид – креатинин – который затем определяют по вышеописанному способу.

Реактивы:

1. Соляная кислота н.
2. Едкий натр н.
3. Реактивы необходимые для определения креатинина.

Техника. Гидролиз. К 10 мл дезальбуминированного фильтрата добавляют 5 мл соляной кислоты н. (1), закупоривают пробирку листом фольги и подогревают в автоклаве до 130° в течение 20 минут или до 150° в течение 10 минут или же в течение 6 часов на кипящей водяной бане; оставляют для охлаждения, затем нейтрализуют 5 мл едкого натра н. (2). Объем доводят до 20 мл, затем берут 10 мл для определения креатинина, которое производится по вышеописанному способу.

Расчет. Необходимо учесть разбавление умножая получаемый результат на 2. Из таким образом полученного значения, представляющего собой сумму креатина + креатинина, вычитается значение креатинина, а разницу умножают на 1,16, получая таким образом значение креатина.

Физиопатологические изменения. В нормальной крови креатинин колеблется в весьма узких пределах: 1,5–2 мг/100 мл, а креатин + креатинин в пределах 3–4 мг/100 мл. Креатинин – эндогенного происхождения; он происходит из мышечной ткани, и следовательно не изменяется в зависимости от режима питания.

Креатинин увеличивается во время удержания мочи вследствие закупорки, а также при нефритах. В случае хронических нефритов гиперкреатинэмия утягощает прогноз. Наоборот, она не имеет никакого значения для прогноза острых нефритов. Креатинин увеличивается также при запорах и сердечных декоменсациях.

Относительное диагностическое значение имеет предложенный французскими клиницистами креатининовый показатель.

При некоторых формах нефритов (лептоспироз, злокачественная дифтерия) креатин увеличивается больше чем креатинин, и таким образом, это соотношение уменьшается. То же самое происходит и при других заболеваниях, как например: обширные ожоги, гипертермия, прогрессивные миопатии, синдром Паркинсона, выраженная кахексия, сильное мышечное утомление и др.

Индикан

Принцип. Индоксил в крови дает с тимолом, в присутствии реактива Обермейера, индиголигнон розового цвета, который можно колориметрировать.

Реактивы:

1. Трихлоруксусная кислота 20%.
2. Тимол 5% в 25° спирте.
3. Реактив Обермейера: растворяют 5 г хлорного железа в 1 ООО мл концентрированной соляной кислоты (уд. вес –1,19).
4. Хлороформ.
5. Стандартный раствор по Марголиной; моча, содержащая небольшое количество индикана может быть использована для приготовления сравнительных стандартов. Для этой цели мочу разбавляют в 50, 100 или 200 раз и из каждого разбавления берут по 1 мл, в который добавляют 2 мл трихлоруксусной кислоты 20% (1), капель тимола 5% (2) и 3 мл реактива Обермейера (3), а спустя 1–2 часа добавляют 2 мл хлороформа.

Хорошо взбалтывают и после разделения жидкостей слой хлороформа должен быть окрашен в розоватый цвет различной интенсивности.

Одновременно таким же образом обрабатывают 1 мл дистиллированной воды. Выбирают разбавления хлороформа, экстракт которого наименьшее отличается с точки зрения окраски от водного экстракта, причем концентрация индикана в этом разбавлении считается равной 0,05 мг/100 мл.

Более значительное разбавление мочи не должно давать какой-либо окраски. После этого делают десятикратное разбавление по сравнению с тем, в котором была отмечена слабая окраска (например, если разбавление 1/200 дало экстракт подходящей окраски, эта моча разбавляется в 20 раз). Затем в ряде пробирок одинакового диаметра (около 1,2 см) по мере возможности изготовленных из бесцветного стекла, замеряют 0,1, 0,2, 0,3, мл этого раствора. Содержание первых 9 пробирок дополняют Дистиллированной водой до 1 мл и затем во все пробирки добавляют по 2 мл трихлор-уксусной кислоты 20% (1), 7 капель тимола и 3 мл реактива Обермейера, а спустя 1–2 часа по 2 мл хлороформа (4). После того как каждая пробирка была подвергнута энергичному встряхиванию, а жидкость осела слоями, пробирки закупориваются хорошо пригнанными пробками и герметизируются парафином. Таким образом, получается серия из 10 пробирок с хлороформовым экстрактом розового цвета, причем интенсивность окраски различна, соответствуя концентрации 0,05; 0,1; 0,2; 0,3... 1 мг/100 мл индикана. Колонка окрашенного реактива, находящаяся над слоем хлороформа не мешает отсчету. Эта окраска сохраняется в течение одного месяца, если пробирки держать в холодном месте.

Техника.

а) Дезальбуминирование. К 2мл сыворотки, добавляют 4 мл трихлоруксусной кислоты 20% (1), хорошо взбалтывают и через несколько минут фильтруют.

б) Определение. К 3 мл прозрачного фильтрата (1 мл сыворотки) добавляют 7 капель тимола 5% (2) и 3 мл реактива Обермейреа (3). Хорошо встряхивают и затем оставляют в покое на 2 часа. После этого добавляют 2 мл хлороформа (4) и снова встряхивают. Окраска хлороформового экстракта сопоставляется с серией стандартных растворов.

Примечания. Реакция является весьма чувствительной, имея предел 0,05 мг/100 мл индикана.

Физиопатологические изменения. В нормальных условиях кровь содержит 0,026–0,080 мг индикана/100 мл. Индикан увеличивается до 0,140 мг/100 мл при болезнях кишечника, а при почечной недостаточности до 0,140–0,160 мг/100 мл. В этом случае, концентрация индикана крови увеличивается раньше концентрации остаточного азота, являясь таким образом более ранним симптомом угрожающей больному уремии. Менее значительные повышения индикана в крови могут встречаться при завороте кишек, тяжелом хроническом запоре и легочной гангрене.

Общие аминокислоты

Колориметрический метод Фолена

Принцип. Аминокислоты дают с нафтохинонсульфонатом натрия окраску сопоставляемую колориметрически с окраской стандартного раствора гликокола, обрабатываемого таким же образом.

Реактивы.

1. Вольфрамат натрия 10%.
2. Серная кислота 2/3 н.
3. Стандартный раствор гликокола: растворяют 37,5 г гликокола и 0,140 г бензоата натрия (для консервирования раствора) в соляной кислоте н. в мерной колбе: 1 мл содержит 0,07 мг азота.
4. Кристаллический карбонат натрия 2,5%. После растворения щелочность титруют соляной кислотой 0,1 и. (индикатор-метилкрасный): 8,5 мл карбонатного раствора должны быть израсходованы для титрования 20 мл соляной кислотой 0,1 н.
5. Фенолфталеин 1%.
6. 3-нафтохинонсульфонат натрия 0,5%. Раствор должен быть свежеприготовленным, а именно за день до употребления, так как порошок трудно растворяется в воде. Сохраняют в темном месте и от времени до времени взбалтывают. В зависимости от обрабатываемых образцов рекомендуется приготовление только 20 мл раствора или даже менее. 2-мя из этого раствора -f- 1 мл ацетат-уксусной кислоты (7) -+* 1 мл раствора тиосульфата натрия 4% (8) должны обесцвечиваться по истечении небольшого промежутка времени (7).
7. Ацетат-уксусная кислота: к 100 мл уксусной кислоты 50% добавляют равный объем ацетата натрия 5%.
8. Тиосульфат натрия 4%.

Техника.

а) Дезальбуминирование. В пробирку отмеривают и смешивают 1 мл плазмы с 7 мл дистиллированной воды, 1 мл вольфрамата натрия 10% (1) и 1 мл серной кислоты 2/3 и. (2). Хорошо встряхивают и фильтруют или центрифугируют на высоких оборотах.

б) Получение окраски. Из прозрачного фильтрата берут 5 мл (0,5 мл плазмы) в пробирку. Одновременно приготовляют стандарт в другой пробирке, в которую вводят по порядку: 1 мл стандартного раствора гликокола (3) (1 мл -j- 0,07 мг азота), 3 мл дистиллированной воды и 1 мл карбоната натрия 2,5% (4).

В каждую пробирку добавляют 1 каплю фенолфталеина 1 % (5). Окраску фильтрата (анализируемого образца) осторожно доводят до красного оттенка стандарта, добавляя несколько капель карбоната натрия 2,5% (вообще достаточно 3–5 капель), затем добавляют 1 мл (3-нафтохинонсульфоната натрия 0,5% (6). К стандартному раствору также добавляют 1 мл (3-нафто- хинонсульфоната натрия 0,5% (6), слегка встряхивают и затем обе пробирки оставляют в покое в течение 19–30 часов в абсолютной темноте в темной комнате. И, наконец, к образцу, как и к стандарту добавляют по 1 мл раствора ацетат-уксусной кислоты (7), 1 мл тиосульфата натрия 4% (8) и 7 мл дистиллированной воды, встряхивают и затем окраски сопоставляют на колориметре Дюбоска.

Метод отличается довольно высокой точностью, причем погрешность не превышает 3–4%.

Формол-титриметрический метод Серенсена

Принцип. Аминовые группы реагируют с формальдегидом, образуя метиленовые группы.
таким образом, что в молекулах аминокислот остаются свободными только карбоксиловые группы, которые титруют едким натром 0,1 н.

Реактивы:

• вольфрамат натрия 10%.
• серная кислота 2/3 н.
• нейтрализованный формалин: к 100 мл формалина 30–40% добавляют 1 мл фенолфталеина 1% и тщательно нейтрализуют едким натром н/5 до слабо розового цвета.
• фенолфталеин 1%.
• едкий натр 0,1 н.

Техника. а) Дезальбуминирование. В пробирку отмеривают и смешивают 2 мл сыворотки, 14 мл дистиллированной воды, 2 мл вольфрамата натрия 10% (1) и 2 мл серной кислоты 2/3 н., затем хорошо встряхивают и фильтруют или центрифугируют на больших оборотах.

Титрование контрольного образца производят смешивая 10 мл кипяченной и охлажденной дистиллированной воды, 5 мл нейтрализованного формалина (3) и 5 капель фенолфталеина 1% (4). Затем добавляют едкий натр 0,1 н. (5) до получения красной окраски.

Предположим, что п – число израсходованных мл (в основном 0,1– 0,2 мл).

в) Определение: к 10 мл прозрачного фильтрата (1 мл сыворотки) добавляют 5 капель фенолфталеина 1 % и внимательно нейтрализуют едким натром 0,1 н. (бледно-розового цвета), затем добавляют 5 мл нейтрализованного формалина и нейтрализуют едким натром 0,1 н. до получения красного оттенка контрольного образца. Предположим, что N – количество мл добавленных после нейтрализации фильтрата.

Расчет. 1 мл едкого натра 0,1 н. соответствует 1,4 мг аминового азота.

Аминовый азот мг/100 мл = (N – n) X 1,4 X 100.

Примечания. Конечная точка изменения окраски не четка, в связи с чем метод менее точен. Кроме того, для некоторых аминокислот он дает заниженные результаты (90 % для валина, аланина, лейцина, пролина и оксипролина, 86% для гистидина) и завышенные результаты для других аминокислот (112% для аргинина). Весьма точным методом является метод Поп и Стивенса.

Физиопатологические изменения. По методу Фолена нормальная кровь содержит 5–8 мг/100 мл аминового азота, плазма 3–6 мг/100 мл, а эритроциты – 7–12 мг/100 мл.

Аминокислоты пищевых белков (эксогенные), абсорбированные через кишечник, а также аминокислоты тканевых белков (эндогенные) в значительной мере дезаминируются в печени до стадии мочевины и только незначительная часть поступает в кровь.

Временное увеличение аминоацидемии наблюдается после приема пищи.

Увеличенное количество аминокислот в крови встречается при острых заболеваниях печеночной паренхимы: желтая атрофия, катарральная желтуха, а также отравления фосфором, мышьяком, хлороформом, при которых они могут достигнуть 20–30 мг/100 мл. Гипераминоацидемии встречаются также при эклампсии, миелоидной лейкемии и некоторых почечных заболеваниях, при которых их уровень изменяется параллельно значению мочевины.

Полипептидный азот

Метод двойного азота

Принцип. Определение общего азота в двух дезальбуминированных фильтратах, первый – трихлоруксусной кислотой, осаждающей только белки, а второй – фосфорновольфраматом натрия, осаждающим также полипептиды. Затем полипептидный азот высчитывается в виде разницы.

Реактивы:

1. Трихлоруксусная кислота 20%.
2. Фосфорновольфрамат натрия 10%. Получается нейтрализацией фосфорновольфрамовой кислоты 10% едким натром 10% в пристутствии 1 капли фенолфталеина 1%.
3. Серная кислота 0,58 н. Наливают 580 мл серной кислоты н. в мерную колбу на 1000 мл и заполняют до метки дистиллированной водой.
4. Реактивы для определения азота посредством микрокиельдаля.

Техника.

1. Трихлоруксусный азот: к двум мл сыворотки добавляют 2 мл трихлоруксусной кислоты 20% (1). Хорошо взбалтывают и фильтруют или центрифугируют на больших оборотах. Определение азота производится на 2 мл прозрачного фильтрата (1 мл сыворотки) методом микрокиельдаля.

2. Фосфорновольфрамовый азот: к 2 мл сыворотки добавляют 4 мл дистиллированной воды, 2 мл фосфорновольфрамата натрия 10% (2) и 2 мл серной кислоты 0,58 н. (3). Хорошо встряхивают, оставляют на 10 минут в покое и затем фильтруют или центрифугируют на больших оборотах. Азот определяют микрокиельдалем на 5 мл фильтрата (1 мл сыворотки).

Расчет. Полипептидный азот мг/100 мл = трихлоруксусный азот = фосфорновольфрамовый азот.

Физиопатологические изменения. Полипептидный азот колеблется в пределах от 4 до 6 мг/100 мл. Соотношение полипептидный N/трихлоруксусный N называемое французскими авторами показателем дезаминирования или показателем недостаточности кливажа изменяется в пределах от 0,12 до 0,15.

Полипептиды в крови происходят из тканевых (эндогенных) белков, причем наибольшая их часть разрушается в печени вплоть до мочевины (так же как и аминокислоты), а остальная часть переходит в кровь, откуда выводится вместе с мочей на уровне почки. При некоторых заболеваниях печени эта последняя уже неспособна вызывать их разрушение в той же пропорции и таким образом они поступают в том же количестве в кровь, где скопляются, так как почка выводит их медленно. Их скопление в крови может иметь место также и тогда, когда паренхима печени не нарушена, но при этом имеется почечное заболевание, препятствующее Нормальному выведению полипептидов.

Полипептидный азот увеличивается при циррозе, тяжелых формах желтухи, уремиях, а также при эволютивных нефритах, при которых он может достигнуть 20–30 мг/100 мл. Соотношение полипептидный N/трихлоруксусный N увеличивается при печеночной недостаточности до 0,30–0,40.

Глутатион

Принцип. Осаждение глутатиона лактатом кадмия, который затем определяется иодометрически. Определение производят на двух одинаковых трихлоруксусных фильтратах, полученных из одного и того же образца. В первом фильтрате определяют восстановленный глутатион, а во втором производится то же определение после воздействия двойного цианида калия и кадмия, превращающего окисленный глутатион в восстановленный глутатион, причем получается общий глутатион. Окисленный глутатион получают в виде разницы.

Реактивы.

1. Трихлоруксусная кислота 10%.
2. Бромтимол синий 0,02%.
3. Едкий натр 30%. Используется разбавленный раствор 1/2.
4. Едкий натр 2%.
5. Лактат кадмия 2%. Для получения чистого лактата кадмия поступают следующим образом: раствор кадмиевой соли обрабатывают теоретическим количеством раствора едкого натрия. Осадок гидроокиси кадмия, отделенный фильтрацией, промывают дистиллированной водой, затем растворяют при нагреве в избытке молочной кислоты. Раствор концентрируют на водяной бане до образования кристаллов, а затем оставляют для дальнейшей кристаллизации охлаждением. Добавляют ацетон, фильтруют и промывают ацетоном или спиртом для нейтральной реакции промывочной жидкости. Кристаллы собирают и высушивают. Раствор лактата кадмия 2% должен давать зеленую окраску с бромтимолом синим 0,02% и оставаться желтым с метилкрасным 0,02%.
6. Фосфорная кислота 10%.
7. Двойной цианид калия и кадмия 5%.
8. Трихлоруксусная кислота 5%.
9. Йод 0,004 н.
10. Крахмал 1%.
11. Тиосульфат натрия 0,002 н. Получают разбавляя раствор 0,1 н., из которого берут 2 мл и дополняют дистиллированной водой до 100 мл в мерной колбе. Проверяют раствором йода 0,004 н., в котором 2 мл = 4 мл тиосульфата 0,002 н.

Техника.

а) Дезальбуминирование. К 5 мл крови тотчас же после взятия добавляют 10 мл трихлоруксусной кислоты 10% (1) во избежание окисления глутатиона при температуре лаборатории. Хорошо встряхивают, фильтруют, затем осадок разводится на фильтре 3 раза, используя каждый раз по 5 мл трихлоруксусной кислоты 10%. Точно измеряют общий объем фильтрата и берут по 10 мл в две центрифужные пробирки, затем приступают к определению.

б) Осаждение восстановленного глутатиона, g первую пробирку добавляют 3–4 капли бромтимола синего 0,02% (2) ц начинают нейтрализацию едким натром 10% (3), разбавленным 1/2, непрерывно помешивая. Когда кислота почти полностью нейтрализована, добавляют по каплям едкий натр 2% (4) до появления первой синей окраски, устойчивой примерно в течение 2 минут, тщательно избегая любой избыток едкого натра, вызывающий окисление группы SH. Лактат кадмия осаждает глутатион без окисления группы SH при pH 6–7. К таким образом нейтрализованному раствору добавляют 1 мл раствора лактата кадмия 2% (5), выделяющего молочную кислоту, причем раствор дает зеленую окраску а затем желтую. Для нейтрализации раствора добавляют несколько капель едкого натра 2% до новой устойчиво синей окраски. Появляется незначительная муть, а для того, чтобы осаждение было полным, оставляют на 1 час или даже до следующего дня в темноте. Затем цетрифугируют 5 минут на больших оборотах, надосадочную жидкость сливают – причем осадок растворяют в 10 мл фосфорной кислоты 10% (6).

Восстановление и осаждение окисленного глутатиона. К фильтрату из второй пробирки добавляют 3–4 капли бромтимола синего 0,02% и нейтрализуют едким натром 30%, разбавленным 1/2, затем едким натром 2% до устойчивой синей окраски, затем добавляют 1 мл двойного цианида калия и кадмия 5% (7), восстанавливающего все количество присутствующего в фильтрате глутатиона. Для того, чтобы достигнуть полного восстановления оставляют в покое на полчаса, после чего добавляют 4 мл лактата кадмия 5% (5).

Изменение окраски в желтую получают добавляя 0,5 мл трихлоруксусной кислоты 5% (8). Затем раствор снова нейтрализуется несколькими каплями едкого натра 2% (4); чтобы быть уверенным в том, что осаждение произошло полностью, добавляют еще 2 мл лактата кадмия 2% (5), а затем в случае необходимости нейтрализуют. Появляется такая же муть и для того, чтобы осаждение было полным оставляют на час или даже на сутки в темноте. Затем надосадочная жидкость сливается, причем осадок растворяют в 10 мл фосфорной кислоты 10% (6) с последующим определением общего глутатиона.

г) Определение. К осадку растворенному в фосфорной кислоте 10% добавляют в избытке йод 0,004 н. (9) точно отмеренный н выявленный с помощью 2–3 капель амидона 1% (10). Затем титруют тиосульфатом натрия 0,002 н. (11) до исчезновения синей окраски.

Расчет. 1 мл йода 0,004 н. соответствует 61,4 мг глутатиону.

Физиологические изменения. Женщины: восстановленный глутатион 16 мг/100 мл; окисленный глутатион 20,6 мг/100 мл.

Мужчины: восстановленный глутатион 17,5 мг/100 мл; окисленный глутатион 23 мг/100 мл.

Глутатион изменяется физиологически главным образом во время пищеварения.

Бибилирубин

Образование и передвижение билирубина в организме

В организме человека ежедневно вследствие старения или разрушения уничтожаются 0,6–3% эритроцитов. Часть этих эритроцитов фагоцитируются клеточными элементами ретикулогистиоцитарной системы.

Вследствие фагоцитоза происходит разрушение гемоглобина этих эритроцитов, превращаемого в билирубин соединенный с глобином (глобулином). Другая часть разрушенных или постаревших эритроцитов уничтожается в селезенке и благодаря тому же процессу разрушения и в данном случае образуется соединенный с глобином билирубин.

Билирубин возникающий при разрушении гемоглобина ретикулогистиоцитарной системой и селезенкой называется косвенным билирубином или внепеченочным билирубином. Этот билирубин переходит в кровь, где таким образом находится в нормальных условиях. Отсюда он достигает печени. Печень разрушает связь билирубина с глобином преобразуя его в печеночный или непосредственный билирубин, который в нормальных условиях отсутствует в крови. Из печени билирубин вместе с желчными кислотами и холестеролом непосредственно поступает через желчные пути в двенадцатиперстную кишку, где участвует в пищеварительном процессе. Отсюда прямой билирубин переходит в толстую кишку, где восстанавливается микробами гниения в уробилиноген. Из этого уробилиногена около 30% поступают в фекалии, где в результате окисления уробилиноген превращается в стеркобилин, удаляемый вместе с фекальными материями. Остальные 70% всасываются через стенки кишечника и через воротную вену, доходят до печени, где частично превращаются в непосредственный билирубин, а остальная часть попадает в кровообращение и выводится через почки вместе с мочей, где весьма быстро окисляется в контакте с воздухом и переходит в уробилин.

Качественное исследование методом Фуше

Принцип. Реактив Фуше окисляет красный билирубин крови в зеленый биливердин.

Реактив Фуше растворяют 25 г трихлоруксусной кислоты в 10 мл воды и добавляют 10 мл раствора хлорного железа 10%.

Техника. В небольшую фарфоровую чашечку или на фаянсовую пластинку наливают каплю негемолизированной сыворотки, а рядом с ней 1 каплю реактива Фуше. Смешивают тонкой стеклянной палочкой Если билирубин не превышает нормального значения, белковый осадок не окрашивается. Если билирубин превышает нормальное значение, билувердин окрашивает белковый осадок в грязно-зеленый более или менее темный цвет, в зависимости от количества пигментов.

Определение колориметрическим методом

Принцип. Билирубин дает с диазо-реактивом Эрлиха (диазотированная сульфаниловая кислота) продукт соединения (комплексное азопроизводное) ярко красного цвета, практически специфичного и довольно интенсивного для выявления в водном растворе 1 мг°/00 билирубина. Поскольку красный цвет пропорционален концентрации присуствующего билирубина его сопоставляют с окраской стандартного раствора сульфата кобальта.

Реактивы.

1. Реактивы диазо: раствор А: взвешивают 0,5 г сульфаниловой кислоты, переводят в мерную колбу на 500 мл, добавляют 125 мл соляной кислоты н. и дополняют до метки дистиллированной водой.
   Раствор Б: взвешивают 0,5 г нитрата натрия и растворяют в 100 мл дистиллированной воды в мерной колбе.
   Реактив приготовляют непосредственно перед употреблением смешивая 10 мл раствора А с 0,30 мл раствора Б.
2. Изотонический раствор NaCl 9%.
3. Спирт 95°.
4. Насыщенный раствор сульфата аммония.
5. Стандартный раствор: отвешивают точно 2,16 г безводного сульфата кобальта или 3,99 г кристаллического сульфата кобальта, переводят в мерную колбу на 1000 мл и дополняют до метки дистиллированной водой. Этот раствор с точки зрения окраски соответствует раствору билирубина 1/200 000 (0,50 мг%).

Качественное исследование. Как было показано выше, нормальные сыворотки содержат только внепеченочный (косвенный) билирубин, соединенный с глобулинами. Эти сыворотки, обработанные диазо-реактивом Эрлиха, дают слабую реакцию соединения, протекающую довольно медленно. Для того, чтобы получить более интенсивную реакцию необходимо предварительно осадить сывороточные белки спиртом. Эта реакция, появляющаяся только после обработки сыворотки спиртом, или другими осадителями, называется косвенной реакцией.

Печеночный билирубин (непосредственный) свободный от глобулинов, вызывает более четкую и быструю реакцию, причем осаждение сыворотки спиртом отпадает. Подобное положение наблюдается при некоторых патологических процессах, при которых непосредственный билирубин переходит в кровь. Именно с этим и связано название непосредственного и косвенного билирубина.

Техника. Берут две пробирки для гемолиза, в которые наливают по 0,5 мл негемолизированной сыворотки. В первую пробирку добавляют 0,4 мл свежеприготовленного диазореактива (1), а во вторую 0,4 мл изотонического раствора NaCl (2). Эта пробирка служит контрольным образцом для сравнения окраски.

Красная окраска может появиться немедленно, достигая наибольшей интенсивности в течение 10–30 секунд или несколько позже, спустя 3–5 минут до 30 минут – одного часа. В первом случае речь идет о мгновенной непосредственной реакции, а во втором – о запаздывающей непосредственной реакции.

Если появляющаяся окраска красновато-желтого цвета и прогрессивно интенсифицируется в течение нескольких минут, то можно говорить о двухфазной непосредственной реакции (Фейгель). И наконец, реакция является косвенной если окраска появляется после добавления спирта.

Определение. Производится по указанию получаемому с помощью качественной реакции, то есть в зависимости от того была ли реакция непосредственной или косвенной.

а) Непосредственная реакция: в центрифужную пробирку наливают: 1 мл негемолизированной сыворотки, 0,5 мл диазореактива (1), 2,9 мл спирта 95° (3) и 1 мл насыщенного раствора сульфата аммония (4). Хорошо встряхивают и затем центрифугируют на больших оборотах (3 000–3 500 об/мин) пока надосадочная жидкость не станет прозрачной. Эту прозрачную жидкость вводят с помощью пипетки в одну из кювет колориметра типа Дюбоска, а в другую кювету наливают стандартный раствор (5). Производится расчет и отмечаются соответствующие высоты.

б) Косвенная реакция: в центрифужную пробирку наливают 1 мл негемолизированной сыворотки и 2 мл спирта 95° (3), закрывают пробкой, хорошо встряхивают, оставляют в покое на 2–3 минуты и центрифугируют пока надосадочная жидкость не станет прозрачной. Затем, в пробирку наливают: 1 мл прозрачной жидкости, 0,25 мл диазореактива (1) и 0,5 мл спирта 95° (3). Слегка встряхивают и через 3 минуты производят отсчет на колориметре Дюбоска, как было указано выше.

Фотометрический метод

Принцип. Тот же как и при способе ван дер Берга. Красный азокраситель общего билирубина получают посредством кофеинового раствора, а краситель непосредственного билирубина – без добавления какого-либо экстракционного реактива. Косвенный билирубин получается в виде ницы посредством вычитания.

Реактивы.

1. Раствор кофеина – бензоата – ацетата. Отвешивают и смешивают: 20 г чистого кофеина, 30 г бензоата натрия и 50 г ацетата натрия, затем добавляют 400 мл дистиллированной воды и растворяют слегка нагревая. После охлаждения фильтруют.
2. Диазо-реактив. Приготовляют таким же образом как при способе ван дер Берга.
3. Изотонический раствор NaCl 0,9%.

Техника. Берут 3 пробирки А, В и С, в которые последовательно вводят:

• Негемолизированная сыворотка;
• Раствор кофеина (1);
• Диазо-реактив (2);
• Изотонический раствор NaCl (3).

В пробирке А получают общий билирубин, в В – непосредственный билирубин, а пробирка С служит как компенсирующий раствор при измерении оптической плотности первых двух пробирок на фотометре Пульфриха.

Отсчет затухания производится зеленым фильтром на 530 му. с кюветой на 10 мм, спустя 3 минуты после добавления последнего реактива.

Расчет: Билирубин мг/100 мл = Е X 6,43 – S, где:
Е = оптическая плотность
S    = коррекция – 0,06.

Косвенный билирубин мг/100 мл = общий билирубин – непосредственный билирубин.

Если билирубин находится в слишком большом количестве до проведения реакции, сыворотку разбавляют дистиллированной водой, причем результат расчета умножают на фактор разбавления.

Если можно ожидать весьма малого количества билирубина, то в таком случае берут двойное количество сыворотки, а расчет на фотометре производится с кюветой на 30 мм.

В этом случае затухание делят на 3, а затем применяют формулу для расчета билирубина. Таким образом полученный результат делят на 2.

Примечания. Для исследования желчных пигментов в крови необходимо, чтобы больной не принимал медикаментов, или пищи, которые могли бы вызвать искусственную окраску сыворотки, как например морковь, апельсины, большие количества зеленых овощей и др. Для определения следует пользоваться только свежей и негемолизированной сывороткой. Консервирование сьюоротки даже в закрытых пробирках, сохраняемых в темноте в холодильнике должно производиться лишь в случае крайней необходимости. Это связано с тем, что спустя несколько часов билирубин в результате окисления может перейти в биливердин, который уже не дает диазо-реакции. Витамин С даже в небольших концентрациях (5 мг) восстанавливает билирубин в уробилиноген, который уже не дает красного цвета.

Физиопатологические изменения. Нормальная кровь содержит от 0,5 до 0,8 мг/100 мл косвенного билирубина. Физиологические изменения билирубина весьма невелики. Билирубин повышается относительно либо после приема пищи, либо в состоянии голодания. Мышечные усилия и беременность могут вызвать легкую гипербилирубинемию в 30–40% случаев.

Патологические гипербилирубинемии встречаются главным образом при любых формах желтухи: гемолитической, обструктивной (механической или функциональной), токсической (отравления хлороформом, фосфором, четырехлористым углеродом, мышьяковыми соединениями) и эпидемической.

При желтухах билирубинемия колеблется в пределах от 5 до 25 кг/100 мл, причем значения от 25 до 35 мг/100 мл наблюдаются редко, свыше 30 мг/100 мл – весьма редко и наконец лишь только в исключительных случаях можно встретить значение превышающее 40 мг/100 мл. Непосредственный билирубин находится в крови при токсической и инфекционной желтухе, при значительном разрушении печеночной паренхимы (цирроз, острая желтая атрофия, а также при обструктивной желтухе). В первых случаях увеличивается также количество уробилиногена в моче, в то время как при обструктивной желтухе уробилиноген отсутствует, а фекальные материи бесцветные (отсутствие стеркобилина).

Косвенный билирубин увеличивается при гемолитической желтухе и бирмериановой анемии, характеризующихся чрезмерным разрушением эритроцитов. В моче желчные пигменты отсутствуют, но зато значительно увеличиваются уробилиноген и уробилин, а фекальные материи интенсивно окрашены (стеркобилин увеличивается).