Основные принципы молекулярно-биологических диагностических технологий
Молекулярно-биологические диагностические технологии заключаются в гибридизации и амплификации нуклеиновых кислот. Общим для этих процессов является воспроизведение механизма дублирования наследственной информации в геноме. Последовательность нуклеотидов в одиночной цепи ДНК или РНК закономерно воспроизводится в последовательности нуклеотидов комплементарной цепи благодаря способности гуанина соединяться по принципу «ключ-замок» только с цитозином, тогда как аденин соединяется только с тимином. Считывание информации и воспроизведение цепи ДНК, РНК или определенных их фрагментов происходит с помощью специфических ферментных систем.
При нагревании ДНК и ее быстром охлаждении, обработке щелочью и другими денатурирующими агентами сначала происходит разрыв наиболее слабых водородных связей, в результате из двунитевых образуются однойитевые последовательности нуклеиновой кислоты. Образовавшиеся комплементарные одиночные цепи можно использовать в качестве матрицы для синтеза новых цепей ДНК.
Гибридизация нуклеиновых кислот представляет собой процесс образования стабильных двунитевых молекул нуклеиновых кислот из комплементарных однонитевых молекул. Спаривание оснований комплементарных цепей нуклеиновых кислот происходит путем образования водородных связей между основаниями, подсоединения зонда к специфическим последовательностям нуклеиновых кислот, которые могут быть или могут не быть продуктами амплификации. В результате образуются гибриды «ДНК-ДНК», или «ДНК-РНК», или «РНК-РНК».
В различных модификациях метода гибридизации нуклеиновых кислот используется подсоединение специфичных зондов, конъюгированных с субстратом или ферментом. Зонд – это небольшая часть ДНК, которую применяют для детекции комплементарной последовательности в реакционной цепи. В результате происходит усиление образующегося сигнала, регистрируемого тем или иным способом в ходе определения. Избираемые ДНК-зонды комплементарны изучаемому фрагменту, например зонд, состоящий из нуклеотидов GATA (гуанин-аденин-тимин-аденин), прилипает к фрагментам СТАТ (цитозин-тимин-аденин-тимин).
Избираемые в качестве зондов олигонуклеотиды часто состоят из 15-20 оснований с точно определенной последовательностью. Зондом с наибольшим потенциалом индивидуальности у людей является олигонуклеотид (САС)5. Эти нуклеотиды с отпечатков пальцев различны у всех людей, за исключением монозиготных близнецов.
Амплификация – это процесс производства множества копий ДНК из участка искомой ДНК или РНК. Выделяют технологии амплификации матрицы и технологии амплификации сигнала. Среди различных технологий для амплификации фрагментов (матрицы) ДНК и РНК следует выделить: полимеразную цепную реакцию (ПЦР, PCR) и ее разновидности – модификации с использованием обратной транскриптазы, ПЦР – мультипраймерную, гнездовую, in situ, количественную; лигазную цепную реакцию (LCR), амплификацию с вытеснением цепи (SDA); амплификацию с использованием транскрипции (NASBA, NFS, 3 SR). К технологиям, применяемым для амплификации сигнала, относятся различные модификации метода гибридизации нуклеиновых кислот, при которых используют специфичные зонды: гибридизация с использованием разветвленных зондов (branched DNA test); ДНК/ РНК-гибридный захват.
