Полярография для определения аналитов в биоматериалах
Принцип метода
Полярография, или вольтамперометрия, — метод анализа, в котором изучается зависимость между силой тока и напряжением на границе «электрод-раствор». В отличие от потенциометрии при вольтамперометрии разность электрических потенциалов на границе двух фаз (между электродом и исследуемым раствором) поддерживается постоянной, а измеряется сила проходящего тока. В классическом варианте полярографии исследуется зависимость тока, протекающего через погруженный в раствор электрод, от величины приложенного электрического напряжения (потенциала). Величина потенциала обычно изменяется в диапазоне от положительного значения в несколько десятых вольта до отрицательного, примерно до двух вольт, записанную кривую называют полярограммой и регистрируют прибором – полярографом.
Большие отрицательные или положительные разности напряжений прилагать нельзя, так как начинается электролиз воды. В специальных датчиках или приборах может измеряться сила тока только при одном, фиксированном значении потенциала. В полярографической ячейке всегда, по крайней мере, два электрода – рабочий, на котором, собственно, и происходят исследуемые процессы, и электрод сравнения, который выбирают так, чтобы его характеристики по возможности не влияли на процессы, происходящие на рабочем электроде.
В выпускаемых промышленностью для клинико-диагностических лабораторий полярографических датчиках в качестве электрода сравнения обычно используется хлорсеребряный, реже каломельный полуэлемент. Иногда используют более сложную электрическую схему, в которой есть еще третий — компенсационный — электрод, разгружающий рабочий электрод от фонового (неспецифического) тока.
Электрохимическая сущность метода заключается в том, что на рабочем электроде молекула исследуемого вещества восстанавливается (получает электрон), реже окисляется (теряет электрон), что обеспечивает прохождение электрического тока в цепи. Условия измерения подбирают так, чтобы величина тока определялась скоростью диффузии молекул к электроду, т.е., в конечном счете, их концентрацией для молекулы каждого вещества характерна пороговая величина электродного потенциала, при которой он может отдать или полнить электрон. При достижении этой величины ток в цепи усиливается, так как в процесс включается новый вид молекул или ионов. При постепенном увеличении электрического потенциала происходит характерный рост силы тока в цепи, называемый полярографической волной. Ее форма позволяет судить о качественном и количественном составе раствора. Потенциал, соответствующий половине высоты волны, так называемый потенциал полуволны, является величиной, характерной для данного вещества. Он зависит также от состава раствора (фона).
Если в растворе находятся несколько электрохимически активных веществ, т.е. способных обмениваться электронами с электродом, полярограмма представляет собой полярографическую кривую с отдельными подъемами (волнами), каждая из которых соответствует какому-то определенному сорту молекул или ионов. Высоты полярографических волн пропорциональны концентрациям веществ, участвующих в реакциях на электроде. Для успешного воспроизведения полярографических эффектов большое значение имеет материал электрода, качество его поверхности и условия перемешивания раствора.
Эти параметры хорошо стандартизуются в классическом варианте полярографии, использующем так называемый ртутный капельный электрод. В нем вытекающая из капилляра ртуть выполняет функцию рабочего отрицательного электрода (катода), поверхность которого непрерывно обновляется, одновременно растущая капля перемешивает раствор. Функцию второго электрода выполняет ртуть, разлитая на дне сосуда. По понятным причинам ртутный капельный электрод неудобен в работе, его используют в основном в научных исследованиях, а для клинико-диагностических лабораторий разработаны и широко применяются специальные аналитические устройства с твердыми электродами, в которых исследуется не вся полярографическая кривая, а измеряется сила тока лишь при том значении потенциала, при котором аналит наиболее специфично участвует в электродных реакциях.
Оптимальная величина потенциала зависит не только от свойств исследуемого вещества, но и от того, какой используется электрод сравнения, поскольку он сам генерирует определенную разность потенциалов по отношению к раствору. В некоторых случаях складывается такая ситуация, что никакой внешний источник электрического напряжения не нужен, его функцию выполняет электродвижущая сила электрода сравнения. На характер полярографической кривой, и, соответственно, силу тока при фиксированном напряжении, влияют не только свойства электрода и состав раствора, но и присутствие катализатора.
Анализируемые вещества далеко не всегда способны непосредственно передавать электроны на электрод (окисляться) или забирать их от него (восстанавливаться), часто это реализуется через посредство промежуточного вещества – переносчика электронов, например соединений железа.
В качестве материала для твердых электродов используют благородные металлы или графит.
Применяют три варианта полярографического определения метаболитов, имеющих клиническое значение. Первый основан на учете потребления кислорода, второй – на образовании пероксида водорода, третий – на использовании в качестве катализаторов ферроценов.
Кислородный электрод – это отрицательно заряженный металлический электрод, на поверхности которого происходит восстановление кислорода воздуха с образованием иона гидроксила ОН". Выбирают такие условия, при которых сила тока в цепи пропорциональна количеству кислорода воздуха в растворе, т.е. величине его парциального давления. Если нет никаких химических реакций с участием кислорода, его концентрация постоянна, она зависит от высоты местности над уровнем моря и температуры. Однако если в растворе идет химическая реакция, в которой потребляется кислород, его парциальное давление падает, что и улавливает прибор.
В компактном кислородном электроде предусмотрена защита от некоторых компонентов пробы, которые могут мешать определению, например от белков. Мембрана из некоторых полимеров, проницаемая для кислорода, отделяет платиновый катод и серебряный анод от исследуемой пробы. В качестве электролита чаще всего используют хлорид калия, который дает стабильный (серебро/хлористое серебро) референтный потенциал.
Поскольку известно много биохимических ферментативных реакций, в процессе которых потребляется кислород, этот принцип реализован в некоторых приборах для определения глюкозы, холестерина, мочевой кислоты в сыворотке крови. Возможность исследовать целый спектр аналитов зависит от состава буферной смеси и используемых ферментов. Ферментная система не обязательно должна быть иммобилизованной, она может функционировать и в растворенном виде.
Кислородный электрод также широко используют для определения парциального давления кислорода Ро2 в биологических жидкостях и тканях (рис. 2.3). Чаще всего он входит в состав анализатора для оценки кислотно-щелочного состояния крови. Так как в крови много веществ, способных участвовать в электродных реакциях, для повышения селективности электрод покрывают тонкой гидрофобной пластмассовой мембраной, через поры которой могут диффундировать только небольшие нейтральные молекулы кислорода, а более крупные органические молекулы не проходят.
Рис. 2.3. Схема устройства Р02 электрода: 1 – катод платиновая проволока (-0,65 В); 2 – стеклянный резервуар; 3 – пластиковый контейнер; 4 – оболочка электрода; 5 – кислородное кольцо; 6 – выход пробы; 7 – пластиковый катод (открытый конец проволоки); 8 – проницаемая для кислорода мембрана; 9 – кювета; 10 – стеклянное окно; 11 – верх пробы; 12 – фосфатный буфер; 13 – анод Ag/AgCl (0 В)
Пероксид водорода, который образуется во многих оксидазных реакциях, можно уловить полярографически. Кислородный датчик можно преобразовать для определения пероксида водорода, если изменить полярность электрода. При положительном потенциале, прилагаемом к рабочему электроду, пероксид водорода окисляется. Такой анодный электрод тоже должен быть изготовлен из платины.
Методы, основанные на полярографическом измерении пероксида водорода, применяют в анализаторах для определения глюкозы, свободного и общего холестерина.
В анализаторе «Эксан-Г» для быстрого определения глюкозы и его модификации «ЭКСАН-Г-И» (экспресс-анализатор глюкозы индивидуального пользования) фермент глюкозооксидаза иммобилизован на пористой полупроницаемой мембране, которая закрывает материал платинового Н202 электрода.
Первый – ацетилцеллюлозный – слой затрудняет диффузию органических веществ (аминокислот, аскорбиновой кислоты и др.), которые могут подвергаться превращениям при потенциале окисления перекиси водорода. Таким образом, повышается специфичность электрода, его избирательность, поскольку к его поверхности пропускаются преимущественно газы и нейтральные молекулы небольшой молекулярной массы. Второй слой мембраны содержит глюкозооксидазу, иммобилизованную в геле с помощью глутарового альдегида. В этом слое происходит ферментативное окисление глюкозы и образование глюконолактона. Третий слой представляет собой лавсановую пленку, защищающую ферментативный слой от загрязнения белками, клетками крови. Он также придает мембране механическую прочность. Ферментный электрод с мембраной закреплен в стенке, заполненной буфером ячейки объемом 1 мл.
При введении полуавтоматической пипеткой 50 мкл пробы она разбавляется буферным раствором в 20 раз. Перемешивание пробы в ячейке происходит с помощью магнитной мешалки, а удаление отработанного раствора, промывка ячейки и заполнение ее буфером – с помощью перистальтического насоса. При введении в измерительную ячейку пробы, содержащей глюкозу, образующийся в ферментной мембране пероксид водорода окисляется на рабочем электроде, вызывая увеличение анодного тока. Сигнал об этом увеличении поступает последовательно в электронный блок, и цифровой индикатор регистрирует показатели глюкозы (ммоль/л) в крови.
Преимущество этого метода – дешевизна реактивов, поскольку мембрана с иммобилизованной на электроде глюкозооксидазой служит несколько месяцев, фактически расходуется только недорогой фосфатный буферный раствор.
Полярографический метод определения глюкозы с использованием в качестве катализатора ферроцена – соединения железа, аналога бензола, в кольце которого пять атомов углерода, реализован в портативных анализаторах гликемии – глюкометрах. Входящее в состав ферроцена железо окисляется глюкозой в присутствии глюкозооксидазы, а затем восстанавливается на электроде. Все необходимые ингредиенты заранее нанесены на полоску (стрип) разового использования, что очень упрощает работу. Стрип (биосенсор) вставляется в прибор концевой частью, напоминающей вилку.
Количественная оценка результатов в этих системах может экономично осуществляться с помощью потенциометрических, полярографических или микрокалориметрических устройств. Нередко ферменты наносят на поверхность ионоселективного электрода, с помощью которого измеряется количество иона, участвующего в катализируемой ферментом реакции (например, чувствительный к кислороду электрод, покрытый слоем, содержащие глюкозооксидазу, измеряет содержание глюкозы в растворе по количеству кислорода, использованного в реакции окисления глюкозы; аммонийчувствительный электрод может быть совмещен с мембраной, содержащей уреазу). Эта схема применения иммобилизованных ферментов является одним из вариантов их включения в состав биосенсоров, т.е. устройств, преобразующих эффект специфического взаимодействия с аналитом, основанного на биологических закономерностях, в сигнал, поддающийся обработке электронным компонентом этого устройства.
Области применения в клинической лабораторной диагностике
Чувствительные к кислороду и пероксиду водорода полярографические электроды применяют для определения концентрации субстратов в клинической химии в специальных анализаторах для определения одного или многих компонентов: глюкозы (гидролиз ее глюкозооксидазой), мочевой кислоты (с уриказой), холестерина (используют два фермента: холестеролэстеразу и холестеролоксидазу), в двухканальных анализаторах для определения глюкозы с другим компонентом (мочевой кислотой, мочевиной, лактатом).
В случае сочетания определения глюкозы с мочевиной для мочевины используют электрод с уреазой, а определение аммиака выполняют кондуктометрическим методом. Эти приборы применяют в лабораториях для выполнения как плановых, так и срочных анализов, в том числе в экспресс-лабораториях, отделениях реанимации, блоках интенсивной терапии и т.д. Устройства, использующие биосенсоры и позволяющие выполнить анализ непосредственно по месту лечения пациента, применяют для быстрого и специфичного определения содержания искомого аналита при неотложных состояниях, в практике семейного врача, непосредственно пациентом в домашних условиях.
В отечественном анализаторе глюкозы «Сателлит» (АО «ЭЛТА») использован биосенсор, содержащий в рабочей зоне глюкозооксидазу и акцептор электронов ферроцен. Этот карманный прибор имеет 4 элемента питания, хранит в памяти 10 последних результатов и применяется для индивидуального самоконтроля уровня глюкозы больными сахарным диабетом, для срочного определения глюкозы у постели больного, например бригадой скорой по-мощи, в экспресс-лаборатории, дежурным персоналом клинических отделений. Газовые полярографические электроды используют для определения нейтральных молекул: в первую очередь кислорода, закиси азота, перекиси водорода, окиси серы, а также некоторых металлов.
