Принцип спектрофотометрических методов
В разделе, в котором были описаны колориметрические методы, мы упомянули о том, что подвержение атома фотонной бомбардировке вызывает возбуждение последнего с испусканием излучения.
Эмиссионный спектр (рис. 8) характеризуется непрерывностью, пока энергия падающего излучения не превышает ионизирующую энергию атома. Если эта последняя превышается, то на непрерывном фоне эмиссионного спектра соответствующего атома появится ряд острых пик, соответствующих «характерным лучам » данного элемента (смещения электронов с энергетических уровней К, L, М, N и др.).
Рис. 8. Эмиссионные спектры: сверху непрерывный спектр с максимумом внизу, непрерывный спектр с характерными излучениями в К и L.
Аналогичный процесс, но с обратным знаком имеет место и в случае абсорбции излучающей энергии: определенный атом (или молекула) селективно абсорбирует излучение с определенными длинами волн, соответствующими уровнями характерных лучей.
Как известно, прохождение излучения через призму вызывает дифференцированное преломление компонентов соответствующего излучения С.
Таким образом, получается спектр изучаемого излучения. Когда это излучение состоит из множества монохроматических волн, при наличии волн любой длины, существующей между нижним и верхним пределами излучения, спектральный анализ ведет к появлению непрерывного спектра. В случае же, в котором излучение состоит из нескольких компонентов, с точно определенными длинами волн, спектральный анализ приведет к образованию прерывистого спектра. Так, например, солнечный свет характеризуется непрерывным спектром, в то время как возбужденные атомы молекулы излучают прерывистые спектры.
Каждый элемент, как и каждый тип сложного вещества имеет свой характерный спектр (эмиссионный и абсорбционный) вследствие специфического расположения периферических электронных уровней. По существу, это обстоятельство дает возможность идентифицировать компоненты того или иного препарата посредством спектрального анализа.
Методы спектрального анализа широко внедрены в промышленности.
В течение последних лет, благодаря особой чувствительности и высокой точности получаемых результатов, эти методы были успешно внедрены и в биохимическом анализе. Спектральные методы используются для количественных и качественных определений, а также для химического разделения препаратов.
Применяемые в спектрохимии приборы делятся на две группы: приборы анализирующие эмиссионный спектр исследуемых препаратов и приборы спектрально анализирующие селективную абсорбцию того или иного вещества.
Приборы первого типа (эмиссионные спектрофотометры) применяются в основном для количественного и качественного анализа твердых препаратов. Если эти вещества представлены металлами, они вводятся в прибор в виде электродов, причем между последними вызывается затем разряд высоковольтного напряжения, что ведет к возбуждению атомов в электродах и таким образом вызывается испускание характерных излучений. В случае, если препарат не состоит из металла, его помещают в тигель подходящих размеров и подвергают подогреву на сильном пламени (пламенный спектрофотометр); кроме того, препарат может быть подвергнут возбуждению электрической дугой или электрическими разрядами в вакууме. Излучения, испускаемые таким образом возбуждаемыми веществами затем пропускаются через призму, а соответствующий эмиссионный спектр фотографируется.
Фиксируемые на фотографической пластинке спектральные полосы подвергаются затем сравнению с заранее приготовленными эталонами. Спектрофотометрический метод является исключительно чувствительным, поскольку с его помощью можно выявить количество достигающее менее одной стомиллионной доли грамма. Все же, следует отметить, что применение этих методов обусловлено помимо наличия специальной аппаратуры, надлежащей технической подготовкой оператора, а также наличием полного набора характерных спектров различных веществ (эталонов).
В медицинской биохимии приобрели широкое применение пламенные фотометры для дозировки катионов в препаратах (сыворотка, плазма, спинно-мозговая жидкость и др.). Благодаря особой точности и быстроте выполнения метод применяется для определения плазматической ионограммы даже во время операции.
Пламенные фотометры, применяемые для подобных определений отличаются особой конструкцией: соответственно разбавленная кровяная плазма подвергается тонкому распылению в сильном пламени, в котором имеет место возбуждение соответствующих атомов (К, Na, Са, Mg). Эмиссионные спектры задерживаются специальными высокоселективными фильтрами, пропускающими только характерное излучение, испускаемое определенным типом атомов (существуют специальные фильтры для К, Na, Са и др., применяемые для каждого исследуемого катиона). Селективно фильтруемое излучение задерживается фотоэлементом, вызывающим в зависимости от интенсивности излучения и следовательно в зависимости от концентрации дозируемого катиона более или менее значительное отклонение с зеркального гальванометра. Таким образом, отсчет отклонения гальванометра позволяет оценить концентрацию изучаемого катиона в анализируемом препарате.
Абсорбционные спектрофотометры более часто применяются для биохимических анализов. С их помощью можно весьма точно произвести количественную оценку химического состава, находящегося в растворе препарата. В схематической форме (рис. 9) такой фотометр представляет собой источник света (3), диафрагмированный (2) и равномерно излучающий, с помощью соответствующей системы линз (1), пропускающих два луча одинаковой интенсивности. Один из этих лучей проходит через анализируемый образец (Кх), а другой через слепой образец пробы (К2). Затем лучи канализируются через систему линз 4 и 6, повторно диафрагмируются в 5, после чего разлагаются с помощью призмы 7. Из полученного спектра анализируются только излучения соответствующие ограниченному диапазону длин волны. Этот анализ проводится посредством поляризатора 8, в котором излучения поляризуются; во взаимно перпендикулярных направлениях, причем ограничение подвергаемых анализу реакций осуществляется посредством диафрагмы 9, пропускающей в анализатор 10 только лучи с желаемой длиной волны.
Рис. 9. Схема спектрофотометрического устройства
Вращая анализатор 10, можно достигнуть выравнивания интенсивности обоих полей. Таким образом, выявляются различия в абсорбции между пробой и эталоном в случае анализируемой длины волны.
Затем для этой же длины волны производится повторное определение угла вращения и анализатора для выравнивания интенсивности полей, причем однако положения кюветы с образцом и кюветы с растворителем взаимоменяются.
После этого можно перейти к спектральному анализу другой группы длин волн и затем в последующем поступая таким же образом, анализируют весь спектр.Параллельно с образцами таким же образом обрабатывается известное количество дозируемого вещества и определяется соответствующее значение Е. Зная это последнее, из вышеприведенной формулы можно рассчитывать концентрацию вещества в образце.
Вследствие того, что спектрофотометрический метод позволяет провести анализ интенсивности абсорбции для волн различной длины, его можно использовать для определения раствора, состоящего из смеси окрашенных веществ. В данном случае проведение операции является несколько более трудоемким, причем для каждого вещества в отдельности необходимо располагать соответствующими контрольными образцами. Так, например, если Ej – абсорбционный коэффициент одного вещества, Е2 – другого, причем сх и с2–концентрации этих веществ в пробе, то для длины волны Хг;
Е' = El сх + Е'2 с2
а для длины волны Х2:
Е" = сх -J- с2
В этих двух уравнениях замещаются значение Е', Е'1 Е'2 Е', Е' и Е., отсчитанные на анализатор или определенные с помощью контрольных образцов и затем решается уравнение с двумя неизвестными (сх и с*); таким образом получаются концентрации обоих компонентов анализируемого раствора.
Определение коэффициентов затухания различных веществ, находящихся в смеси для всего диапазона длины волн, в котором происходит абсорбция, позволяет построить дифференцированные кривые, указывающие абсорбцию каждого компонента в отдельности. Эти кривые строятся отсчитывая на абсциссе длину волны, на которой проводятся определения, а на ординате - интенсивность абсорбции для соответствующей длины волны. Получаемые таким образом кривые определяют абсорбционный спектр анализируемого вещества.
В качестве примера на рис. 10 приводятся характерные абсорбционные спектры. В таблице XVI приведены максимумы абсорбции и значения молярных абсорбционных коэффициентов (к).
Рис. 10. Характерные абсорбционные спектры смеси бензола (1), нафталина (2), антрацена (3), фенантрена (4)
Метод состоит в определении спектра исходного препарата с последующим фракционирующим удалением различных компонентов, экстрагированием или осаждением, и после каждого удаления – в повторном определении абсорбционного спектра препарата. Сравнивая исходный спектр со спектром обработанного препарата, можно идентифицировать вещество, удаляемое во время соответствующей обработки.
В качестве примера в таблице XVII приведены по Нахтрибу результаты спектрохимического анализа одного минерализованного препарата.
Для определения препарат подвергается минерализации (кальцинированию), Затем его переводят в раствор соляной кислотой. Часть этого раствора подвергается спектрофотометрированию (в этом случае рекомендуется, главным образом, спектрофотометрирование на пламенном спектрофотометре). Остальная часть раствора разделяется на несколько одинаковых объемов и к каждому из них добавляется соответствующий осадитель (в данном случае использовался – 8-гидроксихинолат), затем pH растворов изменяется по желанию. Образующиеся осадки удаляются центрифугированием, а надосадочная жидкость подвергается спектрофотометрированию. Получаемый спектр сравнивается с исходным спектром раствора, причем отмечаются разницы, соответствующие каждой надосадочной жидкости, при этом одновременно определяется металл, удаляемый в течение осаждения.
Флуоресцентометрия
Флуоресцентометрия является частным случаем спектрофотометрических методов. В основе этого метода лежит явление (относительно довольно частое в случае растворов органических веществ) повторного испускания характерного излучения, поглощаемого тем или иным веществом. Флуоресцентные зоны расположены в зоне волн значительной длины и низкой частоты, а флуоресцентный квант q определяется известным соотношением.
Между абсорбцией излучаемой энергии и излучением флуоресцентного спектра соответствующий промежуток времени не превышает 10–12 секунд, что представляет особую важность с практической точки зрения, так как дает возможность измерить флуоресценцию одновременно с облучением исследуемого препарата.
В практике флуоресцентометрии необходимо учесть два основных условия:
а) В анализируемом растворе только исследуемое вещество должно обладать флуоресцирующими свойствами (а в случае наличия и других флуоресцентных веществ, они должны не выявляться в рабочих условиях прибора).
б) Возникающее флуоресцентное излучение не должно уменьшаться в присутствии других веществ, способных абсорбировать ее в значительной мере.
Для проведения измерений флуоресцентного излучения, осуществляемого одновременно с облучением исследуемого раствора, между раствором и приемным фотоэлементом необходимо расположить специальный фильтр, задерживающий возбуждающее излучение и пропускающий только флуоресцентное излучение, испускаемое исследуемым веществом. Обычно такие фильтры поставляются вместе с соответствующей аппаратурой; их состав указан в таблице XVIII.
Для данного вещества длина волны флуоресцентного излучения является одинаковой, независимо от возбуждающего излучения. Это дает возможность дифференцировать флуоресцентные вещества в зависимости от длины испускаемого излучения (таблица XIX).
Интенсивность испускаемого флуоресцентного излучения пропорциональна количеству поглощаемого света. Поэтому необходимо работать со стандартизованными источниками возбуждающей энергии, а в случае сравнительных определений строго соблюдать постоянность условий облучения исследуемых растворов.
