Раздельное определение нуклеиновых кислот в тканях

Принцип метода

Определение нуклеиновых кислот после предварительного отделения РНК от ДНК сводится к количественному определению одного из их компонентов (фосфора, пентоз или азотистых оснований). Для устранения мешающих определению примесей количество этих компонентов вычисляют по разности в поглощении света при двух длинах волн.

Аппаратура

1. Спектрофотометр СФ-4.
2. Центрифуга с охлаждением.
3. Термостат на 37°. 
4. Рефрижератор.
5. Водяная баня.

Посуда

1. Пробирки центрифужные мерные.
2. Пипетки на 1, 2, 5 и 10 мл.

Реактивы

1. Жидкий азот.
2. 5 и 10% растворы трихлоруксусной кислоты.
3. 0,5 и 1 н. растворы хлорной кислоты.
4. Хлорная кислота концентрированная.
5. 1 н. раствор едкого кали.
6. Этиловый спирт 96°.
7. Метиловый спирт.
8. Эфир серный.

Ход анализа

Ткань для исследования замораживают жидким азотом, растирают в порошок и отвешивают навеску (500 мг). Одновременно отвешивают еще 100 мг той же ткани для высушивания при температуре 110° до постоянного веса, чтобы знать сухой вес исследуемой ткани.

Навеску (500 мг) обрабатывают 10% раствором трихлоруксусной кислоты на холоду. Осадок отмывают дважды 5% раствором трихлоруксусной кислоты от кислоторастворимых соединений; липиды удаляют из осадка обработкой 96° этиловым спиртом, кипячением в смеси этанол – эфир (3:1) в течение 3 минут, в смеси метиловый^ спирт – эфир (1:1) в течение 30 минут и обработкой эфиром. Остаток высушивают в термостате при 37 градусах.

Сухой остаток инкубируют в 1 мл раствора едкого калия в течение 18 часов при 37° в соотношении 1 Мл щелочи на каждые 100 мг исходного веса ткани. К охлажденному гидролизату прибавляют концентрированную хлорную кислоту по 0,1 мл на 1 мл раствора едкого кали. Осадок отделяют центрифугированием и промывают дважды 1 н. раствором хлорной кислоты на холоду. Надосадочную жидкость, содержащую рибонуклеотиды, объединяют с промывными жидкостями и доводят до определенного объема (10 мл) 1 н. раствором хлорной кислоты. ДНК экстрагируют из осадка 1 н. раствором хлорной кислоты двукратным нагреванием при 80° по 30 минут. Полученные растворы, содержащие РНК и ДНК, спектрофотометрируют при следующих длинах волн; для РНК – 260 и 286 лиц; для ДНК – 268 и 284 тр, против контроля, которым служит в случае РНК 1 н. раствор едкого кали/ обработанный таким же образом, а для ДНК – 1 н. раствор хлорной кислоты.

Так как поглощение ультрафиолетового света примесей одинаково при этих двух длинах волн, а поглощение РНК максимально при 260 тр и минимально при 286 тц (соответственно для ДНК 268 и 284 тц), то при таком определении получают содержание РНК и ДНК без примесей.