Микроопределение глютатиона крови кадмиевым методом

Принцип метода

Белки осаждают трихлоруксусной кислотой, а глютатион, оставшийся в растворе, осаждают сернокислым кадмием. При этом вещества, мешающие определению, остаются в растворе. Глютатион реагирует с молекулярным бромом, образующимся в результате реакции. Избыток молекулярного брома вытесняет из йодистого калия йод, который оттировывается гипосульфитом.

Аппаратура

1. Центрифуга электрическая.
2. Водяная баня.

Посуда

1. Центрифужные пробирки.
2. Конические колбы на 25 мл с притертыми пробками.
3. Микробюретки.
4. Микропипетки на 0,1 и 0,2 мл.
5. Пипетки на 1 и 5 мл.
6. Пипетка (точная) на 2 мл.

Реактивы

1. 20% раствор трихлоруксусной кислоты.
2. 2.5% раствор сернокислого кадмия.
3. 0,2% раствор сернокислого кадмия.
4. 1 н. раствор едкого натра.
5. Раствор бромноватокислого калия: основной 0,001 н. раствор. Растворяют 0,1670 г соли в 1 л воды.
6. Рабочий 0,0001 н. раствор. К одной части предыдущего раствора прибавляют 9 частей дистиллированной воды.
7. 10% раствор бромистого калия или натрия (NaBr).
8. Насыщенный раствор двуосновного фосфата натрия.
9. 1% раствор крахмала.
10. 0,001 н. раствор гипосульфита.
11. 1 н. раствор соляной кислоты.
12. Йодистый калий в порошке.
13. Цинковая пыль.

Ход анализа

Определение восстановительного глютатиона

В центрифужную пробирку вносят 0,1 мл исследуемой крови и ОД мл трихлоруксусной кислоты, перемешивают и уставляют стоять 5 минут, после чего центрифугируют 2–3 минуты. Туда же добавляют 0,8 мл дистиллированной воды, перемешивают, стараясь не взмутить осадка, и снова центрифугируют. 0,5 мл прозрачного центрифуга переносят в чистую пробирку и добавляют 1 мл дистиллированной воды, 1 мл 5%. раствора сернокислого кадмия и 0,2 мл 1 и. раствора едкого натра. Перемешивают встряхиванием и оставляют стоять полчаса. Центрифугируют и центрифугат осторожно отсасывают.

К осадку прибавляют несколько миллилитров 0,2%. раствора сернокислого кадмия и тщательно перемешивают стеклянной палочкой. Палочку вынимают и осторожно ставят кончиком вверх в стаканчик, - чтобы не потерять приставшего к ней осадка. Раствор опять центрифугируют, центрифугат отсасывают.
К осадку опять добавляют несколько миллилитров 0,2% раствора сернокислого кадмия, перемешивают той же палочкой, центрифугируют и т. д. Всего промывают 3 раза, чтобы полностью удалить все редуцирующие вещества, которые могут помешать анализу. После последнего промывания к осадку добавляют 3 мл 1 н. соляной кислоты. Осадок при этом растворяется.

Раствор из центрифужной пробирки количественно переносят в колбочки с притертыми пробками. Туда же прибавляют 3–4 капли 10% раствора бромистого калия и точно 2 мл 0,0001 н. раствора бромноватокислого калия. Перемешивают, закрывают пробкой и оставляют на 8 минут. Затем прибавляют 1,5 мл насыщенного раствора фосфата натрия и несколько кристаллов йодистого калия, закрывают пробкой, встряхивают и прибавляют 2–3 капли раствора крахмала. Титруют 0,001 н. раствором гипосульфита.

Для проведения контроля в колбочку с притертой пробкой берут 2 мл 1 н. раствора соляной кислоты, 0,5 мл 0,2% раствора сернокислого кадмия и приливают все те же реактивы, что и в опыт (с момента растворения осадка). Обычно на титрование контроля идет 0 98–1 мл 0,001 н. раствора гипосульфита.

Определение общего глютатиона

К первому раствору, полученному после прибавления 3 мл и раствора соляной кислоты к кадмиевому осадку, прибавляют 0,01–0,02 г цинковой пыли и держат в кипящей водяной бане, пока вся пыль не перейдет в раствор (на это требуется обычно полчаса). Пробирку закрывают пробкой. После охлаждения прибавляют те же реактивы, как это было описано выше.

Желательно проводить параллельные исследования. Поэтому для одновременного определения восстановленного и общего глютатиона исследуемую кровь берут сразу в четыре пробирки.

Расчет

Содержание восстановленного и общего глютатиона крови можно вычислить по одной и той же формуле.
Разница между общим и восстановленным глютатионом соответствует окисленному глютатиону. В норме общий глютатион составляет 30–45 мг%, восстановленный – 20–30 мг% и окисленный – 2–12 мг%.