Определение активности карбоангидразы крови
В данной статье мы рассмотрим определение активности карбоангидразы крови (по Бринкману в модификации Е. М. Крепса и Е. Ю. Ченыкаевой).
Реактивы
Раствор № 1
10 мл 0,1 н. раствора хлористоводородной кислоты и 10 мл. 0,1 н. раствора бикарбоната натрия отмеривают в мерную колбу емкостью в 200 мл и доливают водой до метки. 2
Раствор № 2
К 200 мл 0,5 М раствора бикарбоната натрия прибавляют 9 мл 0,5 М раствора карбоната натрия и 15 мг фенолрота. Указанные растворы смешивают. В результате протекает реакция Na2 СО3Ч-Н2СО2 2NaHC03 и изменяется pH, что фиксируется индикатором. Скорость реакции определяется временем от начала смешения до изменения окраски индикатора. Добавляемая кровь в смесь реактивов изменяет скорость реакции.
Реакционные сосуды для определения активности карбоангидразы крови
В вышеописанной методике определения карбоангидразы крови применяется U-образный сосуд со ртутью. Ртуть является небезвредной для организма. Работать с нею необходимо очень осторожно, чтобы не разлить.
В связи с этим исследователи предпринимают попытку создать более совершенное приспособление для определения активности карбоангидразы крови по вышеуказанной методике. На рис. 106 показано одно из таких приспособлений, разработанное М. И. Гуйтур (1976). Указанное приспособление создает более безопасные условия для работы с ртутью, но все же технология его изготовления сложна и возможна лишь в условиях стеклодувной мастерской. Для работы с ним необходим дополнительный специальной конструкции штатив.
Рис. 106. Сосуд для определения активности карбоангидразы крови: 1 —- емкость; 2 — узкие пробирки, которыми заканчивается емкость 1; 3 — пробка
Нами разработаны реакционные сосуды более компактные, которые могут быть изготовлены без обращения в мастерскую (рис. 107).
Рис. 107. Реакционные сосуды для определения активности карбоангидразы крови: а — сосуд из органического стекла; б — сосуд на основе бутылочки из-под пенициллина; 1 — пробки, с помощью которых емкости герметически закрывают; 2 — внутренние перегородки; 3 - емкости
Сосуды (а) изготовляют склеиванием из тонкого (1-2 мм) плексигласа. Сосуд (б) монтируют на бутылочке из-под пенициллина. Для этого внутри него вклеивают из плексигласа или стекла перегородку 2. Перегородку перед ее помещением в сосуд разрезают на две части.
Затем в сосуде их склеивают. Растворы № 1 и 2 по вышеописанной методике вносят каждый в равные части 3 сосудов, закрывают пробками и, встряхнув 2-3 раза, опрокидывают их, затем в таком виде погружают в термостатирующую смесь лед-вода. После регистрации времени реакции сосуды вынимают из термостатирующей смеси, моют водой, высушивают и применяют для последующего определения.
Ледяной термостат для определения активности карбоангидразы крови
Обычно реакционные сосуды, в которых определяется активность фермента карбоангидразы по вышеописанной методике, термостатируются в какой-нибудь емкости со смесью льда и воды. Нами для этих целей разработан термостат (рис. 108).
Рис. 108. Ледяной термостат для определения активности карбоангидразы крови: а — общий вид термостата; б — вид на термостат сверху; в - крышка к круговому устройству; 1— прорезь в крышке; 2 — крышка; 3 — цилиндр; 4 — отверстия в круговом устройстве; 5 - меньший резервуар; 6 — реакционный сосуд; 7 - перегородки; 8 — кожух-емкость термостата, состоящий из большего и меньшего резервуара; 3 — круговое устройство; 10 — больший резервуар; 11 — гнезда для реакционных сосудов; 12 — радиальные отростки в круговом устройстве 9; 13 — отверстия в круговом устройстве 5; 14— окошко в кожухе-емкости для наблюдения
Термостат изготовляют из плексигласа. Кожух-емкость состоит из большого резервуара 10, в котором жестко закреплен меньший резервуар 5 со множеством отверстий по его площади. Между ними образуется пространство для термостатирующей смеси. С передней стороны в кожухе-емкости имеется окошко 14, которое образуется перегородками 7 с мелкими отверстиями и стенками большого и меньшего резервуаров. Круговое устройство 9 представляет собой цилиндр 3 со множеством мелких отверстий 4, на наружной стороне которого имеются радиальные отростки 12, образующие вместе с цилиндром гнезда 11 для реакционных сосудов. На нижнем конце цилиндр заканчивается дном со множеством отверстий 13. Диаметр дна цилиндра включает и длину отростков. В верхнем конце устройства 9 снаружи имеется паз, в котором свободно скользит крышка 2 с прорезью 1 в ней для установки реакционных сосудов в гнезда кругового устройства. Круговое устройство поворачивается вокруг своей оси в меньшем резервуаре 5. Для эксплуатации свободное пространство в кожухе-емкости, внутреннюю часть цилиндра кругового устройства, донную часть внутреннего меньшего резервуара заполняют мелкоизмельченным льдом. При оттаивании льда образуется вода, которая заполняет свободное ото льда пространство в термостате, в том числе окошко 14; кусочки льда в него не могут попасть, так как отверстия в перегородках 7 очень малые. В образовавшуюся смесь (лед и вода) погружают устройство 9, в гнезда 11 которого сквозь прорезь 1 в крышке 2 помещают реакционные сосуды 6.
Термостат может применяться и в других биохимических методиках.
