Определение белка по методу Лоури

Принцип метода

Метод основан на образовании биуретового комплекса, который в присутствии фенола дает характерную окраску, пропорциональную количеству белка.

Чувствительность метода – 0,2 н-г в 0,05 мл.

Аппаратура

1. Спектрофометр СФ-4 или фотоэлектро- колориметр.

Посуда

1. Пипетки на 1 и 2 мл с делениями.
2. Мерные цилиндры или колбы на 100 мл.
3. Мерные колбы на 1 л.
4. Круглодонная колба на 1,5–2 л.
5. Холодильник Либиха.
6. Пробирки на 3–10 мл.

Реактивы

1. 0,1 н. раствор едкого натра.
2. 2% раствор углекислого натрия в 0,1 н. раствора едкого натра (реактив А).
3. 0,5% раствор сернокислой меди (CuS045H20) в 1% растворе виннокислого натрия или калия (реактив В). Растворяют 10 г соли в 300 мл дистиллированной воды. В полученный раствор вносят 5 г сернокислой меди и после ее растворения объем доводят дистиллированной водой до 1 л.
4. Реактив С. Перед анализом смешивают 49 мл реактива А с 1 мл реактива В.
5. Вольфрамовокислый натрий, химически чистый в порошке.
6. Молибденовокислый натрий химически чистый в порошке.
7. Ортофосфорная кислота (Н3РО4).
8. Соляная кислота концентрированная.
9. Реактив Фолина. В круглодонную колбу на 1,5– 2 л вносят 100 г вольфрамовокислого натрия и 25 г молибденовокислого натрия и растворяют их в 700 мл дистиллированной воды. К раствору добавляют 50 мл 85% фосфорной кислоты и 100 мл концентрированной соляной кислоты. К колбе присоединяют обратный холодильник и смесь кипятят на сетке в течение 10 часов. После окончания кипячения в колбу вносят 150 г сернокислого лития (L12SO4), добавляют 50 мл дистиллированной воды и 5 капель бромной воды. Смесь кипятят без холодильника 15 минут под тягой. Затем раствор охлаждают до комнатной температуры, доводят объем ее водой до 1 л, фильтруют и хранят в темной склянке с притертой пробкой. Необходимо определять кислотность полученного реактива. Для этого реактив разводят в 10 раз и титруют 0,1 н. раствором едкого натра по фенолфталеину.
10. Реактив Е. Готовят из реактива Фолина, разводя последний дистиллированной водой таким образом, чтобы кислотность приготовленного раствора была равна 1 н. Так, например, если при титровании реактива Фолина оказалось, что его кислотность равна 2,3, то для приготовления реактива Е необходимо взять 10 мл реактива Фолина и 13 мл дистиллированной воды. Реактив Е можно хранить длительное время.

Ход анализа

К 2 мл исследуемого раствора белка добавляют 4 мл реактива С. Смесь энергично перемешивают и через 10 минут добавляют 0,2 мл реактива Е.

Снова тщательно перемешивают и пробирку оставляют при комнатной температуре на 30 минут. Интенсивность синей окраски измеряют на спектрофотометре СФ-4 при длине волны 750 или на ФЭК-М с красным светофильтром.

Расчет

Концентрацию белка в пробке определяют по полученным значениям оптической плотности с помощью калибровочной кривой. Калибровочную кривую строят на основании ряда точно приготовленных белковых растворов нисходящей концентрации. В тех случаях, когда необходимо получить правильное представление об абсолютном содержании белка, для построения калибровочной кривой следует брать кристаллический препарат чистого белка, даже не имеющего отношения к изучаемому белку. На рис. 1 представлена такая калибровочная кривая, для построения которой был использован четырежды перекристаллизованный препарат яичного альбумина; реакция Лоури проводилась описанным выше способом. Пробы фотометрировались с помощью спектрофотометра СФ-4.

Рис. 1. Калибровочная кривая для определения белка по методу Лоури. Четырежды перекристаллизованный препарат яичного альбумина.