Микозы

Микозы – заболевания животных и человека, вызываемые патогенными и условнопатогенными грибами, которые могут поражать кожу и ее придатки (кератомикозы, дерматомикозы, хромомикоз), слизистые оболочки (кандидоз, риноспоридиоз), подкожную клетчатку и лимфатические узлы (актиномикоз, мицетомы, споротрихоз) и различные внутренние органы (глубокие, или висцеральные микозы — гистоплазмоз, кокцидиоидомикоз, криптококкоз и др.). Микозы занимают важное место в инфекционной патологии человека и животных, но до последнего времени они остаются сравнительно малоизученными; Многие микозы являются зооантропонозамй и передаются  преимущественно от больных животных.

Этиология

Возбудителями микозов являются грибы – хлорофильные низшие растения, подавляющее большинство которых непатогенны для человека и животных. Ранее считалось, что большая часть возбудителей грибковых заболевании людей принадлежит к классу несовершенных грибов (Fungi imperfecti), однако за последние годы совершенные формы выявлены не только у большинства дерматофитов (Nannizzia и Arthroderma), но и у возбудителей глубоких микозов. Патогенные грибы принадлежат к 3 классам (аскомицеты, фикомицеты и несовершенные грибы) и характеризуются наличием мицелия или дрожжевых почкующихся клеток. У мицелиальных грибов, как правило, имеются характерные органы плодоношения (спороносцы, споры, макро- и микроконидии) или другие морфологические структуры («завитки», «спирали», «булавы», «канделябры», «гребешковые органы» и др.), на основании обнаружения и характеристики строения которых производится идентификация возбудителей микозов. Дрожжеподобные грибы (чаще всего – возбудители кандидозов) могут образовывать псевдомицелий, хламидоспоры, ростковые трубки. Истинные дрожжевые грибы редко вызывают заболевания человека, за исключением Cryptococcus neoformans, которые являются возбудителями хриитококкоза.

Систематика патогенных грибов, несмотря на разносторонние исследования, проведенные фитопатологами и медицинскими микологами, до настоящего времени окончательно не уточнена (1,5,6, 16).

Эпидемиология

В последние годы достоверно установлено, что природным резервуаром большого числа патогенных для человека грибов является почва (3, 5, 9, 12, 19, 21). В почве длительно сохраняются в жизнеспособном состоянии и размножаются возбудители дерматомикозов, актиномикоза и нокардиоза, споротрихоза, мицетом, кокцидиоидомикоза, гистоплазмоза, бластомикоза и других микозов. Некоторые микозы являются строго эндемичными и постоянно обнаруживаются только на определенных территориях (например, кокцидиоидомикоз – в западных штатах США, гистоплазмоз – в центральной и юго-восточной частях Северной Америки, паракокцидиоидомикоз – в Южной Америке, «африканский» гистоплазмоз – в странах Африки и т. д.), отсутствуя при этом в других местах. Другие заболевания преобладают в зонах тропического (или наоборот – умеренного) климата, но могут встречаться и на остальных территориях (споротрихоз, мицетомы, фикомикозы, хромомикоз). Наконец, значительное количество микозов распространено повсеместно, на разных континентах (дерматомикозы, кандидозы, плесневые микозы).

Возбудители эндемичных микозов обитают, как правило, в почве, откуда они попадают в воздух и затем (через дыхательные пути)– в организм человека. Такой механизм распространения характерен для кокцидиоидомикоза и гистоплазмоза, возбудителями которых в эндемичных зонах инфицировано большинство людей и животных. Правда, заболевания, возникающие в результате первичного контакта человека с возбудителем кокцидиоидомикоза или гистоплазмоза, протекают доброкачественно и лишь у 0,1% больных в дальнейшем развиваются тяжелые висцеральные формы этих глубоких микозов (1, 6, 19). Случаи заражения людей от больного человека или животного неизвестны.

При других микозах (споротрихоз, хромомикоз, мицетомы) возбудители также обитают в почве или на различных растительных субстратах, но приникают в организм человека обычно не респираторным путем, а при травме с повреждением целостности кожных покровов. Больные этими микозами также не представляют опасности для окружающих здоровых людей, Наконец, возбудители дерматомикозов также могут обитать в почве, которая нередко является источником патогенных дерматофитов. Однако в результате длительной эволюции часть этих грибов приспособилась к облигатному паразитизму только в организме человека, а некоторые дерматофиты могут поражать человека и животных и в почве в сапрофитном состоянии не встречаются (5, 16, 17, 21). Тем не менее все виды дерматофитов (антропофильные, зооантропофильные и геофильные) в течение длительного времени могут сохранять жизнеспособность в стерильной почве, а геофильные дерматофиты – и в нестерильной почве.

По данным Отченашека и Дворака (21), которые выделяют 42 самостоятельных вида дерматофитов, 9 из них могут проникать в организм человека и животных из почвы, 10 видов попадают к человеку от больных животных и только 12 видов являются строго атропофильными грибами. Детальная классификация дерматофитов приведена в ряде обстоятельных публикаций, из которых.наибольшего внимания заслуживают работы американского миколога L. Ajello (16, 17).

Клинические черты

Симптоматология грибковых заболеваний очень многообразна и зависит не только от вида возбудителя и его биологических особенностей, но и от локализации очага поражения, возраста больного, иммунологической реактивности макроорганизма и ряда других факторов. Существует много клинических классификаций микозов, из которых наиболее рациональной является классификация А. Н. Аравийского (1), которая приводится ниже в несколько модифицированном нами виде.

1. Поверхностные микозы.

А) кератомикозы (микозы рогового слоя): а) с поражением эпидермиса кожи – разноцветный лишай, эритразма, черный микоз ладоней и подошв; б) с поражением волос – белая пьедра, черная пьедра, узелковый (аксиллярный) трихомикоз;

Б) дерматомикозы: а) поражающие только кожу – эпидермотифия; б) поражающие кожу и ногти – микозы стоп; в) поражающие кожу, ногти и волосы – трихофития, микроспория и фавус.

2. Глубокие микозы.

A) с преимущественным поражением внутренних органов (кокцидиоидомикоз, гистоплазмоз, криптококкоз, бластомикоз, паракокцидиоидомикоз, нокардиоз, аспергиллез, мукороз);

Б) с преимущественным поражением слизистых оболочек и респираторной системы – геотрихоз, кандидоз, риноспоридиоз;

B) С преимущественным поражением глубоких слоев кожи и подкожной ткани – актиномикоз, хромомикоз, споротрихоз, мицетомы.

3. Аллергические заболевания грибковой этиологии (микотическая респираторная аллергия). Хромомикоз, споротрихоз и мицетомы зарубежными исследователями выделяются, обычно, в самостоятельную группу «подкожных микозов» (19).

В Советском Союзе среди заболеваний грибковой природы, регистрируемых у человека и домашних животных, наибольшее значение имеют дерматомикозы, однако в последние годы значительно чаще стали выявлять в нашей стране и глубокие (системные) микозы (9, 12), которые ранее не считались xapaктерными для стран с умеренным климатом. Для глубоких микозов помимо поражения наружных покровов (а нередко и при отсутствии таких поражений) характерно наличие патологических изменений в различных внутренних органах (чаще – в легких, селезенке, центральной нервной системе). Клиническая картина и симптоматология глубоких микозов обусловлена локализацией очагов поражения и не имеет обычно специфических для микозов проявлений. Тем не менее комплекс клинических признаков в сочетании с особенностями эволюции заболевания, эпидемиологическими данными и соответствующей «микологической настороженностью» врача позволяет в соответствующих случаях заподозрить грибковую природу заболевания и применить специальные методы лабораторной диагностики.

Для детального знакомства с клиникой микозов можно рекомендовать ряд отечественных и зарубежных монографий и руководств. Что касается дерматомикозов, то ввиду их широкого распространения в нашей стране хотелось бы подчеркнуть преобладание в клинической картине этих микозов поражений наружных покровов – кожи, ногтевых пластинок, волос. При трихофитии и микроспории на волосистой части головы возникают участки алопеции в результате обламывания и выпадения пораженных грибами волос. Могут возникать эритематосквакозные, пустулезные и инфильтративно-нагноительные очаги поражения. На участках гладкой кожи обычно наблюдается формирование эритематозных и эритемато-сквамозных очагов, по периферии которых имеются характерные везикулезные высыпания (1, 2, 3, 5, 15). Описаны также генерализованные формы дерматомикозов и поражения дерматофитами внутренних органов (головного мозга, лимфатических узлов, костной ткани и др.) при висцеральных формах трихофитии и фавуса (1, 5).

Ввиду того, что микозы в большинстве случаев протекают как хронические заболевания, в организме больных людей или животных происходят выраженные иммунологические изменения, выявляемые с помощью серологических реакций или аллергических тестов (5, 6, 14, 18, 19, 20).

Лабораторная диагностика

Ввиду значительного полиморфизма клинических проявлений грибковых заболеваний и нередкого отсутствия патогномоничных для того или иного микоза симптомов, особое значение приобретает лабораторная их диагностика. При этом решающая роль принадлежит чаще всего не столько самому факту обнаружения патогенных грибов (что позволяет установить природу заболевания, но не раскрывает видовой или даже родовой характеристики возбудителя), сколько окончательной их идентификации. Правда, при ряде болезней грибковой природы морфология тканевых форм очень характерна, что позволяет высказывать обоснованные предположения о таксономической принадлежности возбудителя еще до выделения его культуры (как это имеет место, например, при кокцидиоидомикозе, актиномикозе, споротрихозе, хромомикозе, некоторых дерматомикозах). Тем не менее для правильной диагностики микоза рекомендуется применение комплекса лабораторных методов исследования.

Микроскопическое исследование

При дерматомикозах материалом для исследования являются пораженные волосы или кожные (ногтевые) чешуйки из очагов поражения, которые после предварительной обработки 10-30%-ным раствором щелочи (КОН или NaOH) исследуют с помощью обычного светового микроскопа. При этом в кожных или ногтевых чешуйках обнаруживают нити мицелия и в небольшом количестве – споры, а в волосах – споры и скопления мицелия. По характеру расположения спор в волосе можно ориентировочно определить род возбудителя (трихофитон или микроспорум) и, следовательно, некоторые эпидемиологические особенности заболевания (1, 2, 5, 15, 23).

При глубоких микозах материалом для исследования является гнойное или серозно-геморрагическое отделяемое абсцессов и фистул, мокрота, ликвор, плевральная жидкость. Для актиномикоза и мицетом характерно наличие в гнойном отделяемом специфических «друз» или «зерен», при споротрихозе в гнойном отделяемом язв или в пунктате абсцессов обнаруживаются характерные веретенообразные тканевые формы возбудителя; в ликворе больных криптококкозом могут быть выявлены почкующиеся инкапсулированные клетки патогенных криптококков, а исследование мокроты больного кокцидиоидомикозом нередко позволяет обнаруживать типичные для этого заболевания «сферулы». В то же время следует помнить, что при микроскопическом исследовании патологического материала нередко могут обнаруживаться структуры, очень сходные с тканевыми формами возбудителей глубоких микозов и являющиеся причиной гипердиагностики глубоких микозов. При исследовании материала от больных микозами препараты можно окрашивать обычными методами, применяемыми в бактериологии, или использовать специальные способы окраски.

Люминесцентный метод с успехом применяется для выявления мелких и свежих очагов поражения у больных микроспорией и может быть использован при массовых обследованиях детей дошкольного возраста, школьников, домашних животных и других контингентов людей или животных. Метод основан на свойстве волос, пораженных микроспорумами, светиться ярко-зеленым светом в ультрафиолетовых лучах.

Для обследования используют обычную ртутнокварцевую лампу с фильтром Вуда, который пропускает только короткие ультрафиолетовые лучи. Следует помнить, однако, что способностью к свечению в ультрафиолетовых лучах (зеленоватого или коричневого цвета) обладают такие волосы, пораженные возбудителем фавуса.

Гистологическое исследование

Показано прежде всего при лабораторной диагностике глубоких микозов, а также при диагностике заболеваний, вызываемых условно патогенными грибами (аспергиллез, мукороз, цефалоспориоз и другие плесневые микозы). При этих заболеваниях однократное и даже повторное выделение из очага поражения или из патологического материала плесневого гриба, известного как сапрофитный микроорганизм, не позволяет с уверенностью говорить о грибковой природе болезни. Изучение тканевой реакции в очаге поражения и поведения гриба в организме хозяина помогает правильно определить этиологию болезни. Гистологическое исследование полезно и при выяснении реакции лабораторных животных на введение предполагаемого возбудителя микоза.

Биопсированные ткани готовят для гистологического исследования обычными методами (замораживающий микротом, парафиновые блоки). Специфика гистологического исследования материала от больных с подозрением на грибковое заболевание состоит в применении специальных методов окраски препаратов, основанных на особенностях химического строения грибковых клеток (высокое содержание полисахаридов). Используют окраску реактивом Шиффа по Гочкис-Мак-Манусу, окраски по Гридлею, по Гомори-Грокотту, по Брауну-Бренну, по Майеру и др. Тканевые реакции при микозах подробно описаны Р. А. Аравийским (11) и О. К. Хмельницким (13), однако ввиду трудоемкости и значительных затрат времени гистологические исследования в эпидемиологической практике распространения не получили.

Микологическое исследование

Выделение культуры патогенного гриба имеет решающее значение при окончательной диагностике грибковых заболеваний и идентификации их возбудителей. Для этого требуется применение большого количества специальных питательных сред (в зависимости от предполагаемого вида возбудителя), рецептура которых приводится во всех руководствах по медицинской микологии. При этом, вследствие диморфизма многих возбудителей глубоких микозов, рекомендуется одновременно использовать несколько питательных сред и различные режимы инкубации посевов ( + 28° для получения мицелиальной фазы и +37° для получения дрожжевой фазы у возбудителей гистоплазмоза, кокцидиоидомикоза и других висцеральных микозов). Общим для всех микологических исследований является необходимость использования большого количества материала для исследования и многократного повторения попыток выделения культуры возбудителя. При этом для подавления роста сопутствующей бактериальной флоры и сапрофитных плесневых грибов в состав питательной среды необходимо добавлять соответствующие антибактериальные (пенициллин, стрептомицин, неомицин) и противогрибковые (актидион) антибиотики. Следует учитывать, однако, что актидион может угнетать и рост некоторых патогенных грибов, поэтому его следует применять с известной осторожностью.

Рост грибов происходит, как правило, очень медленно, поэтому наблюдение за посевами производят в течение длительного времени (до 3-4 недель). Идентификацию выделенных грибковых культур осуществляют на основании макроформа и консистенция колоний, их цвет, скорость роста, характер поверхности, наличие диффундирующего в питательную среду пигмента и т. д.) и микроскопических признаков (органы плодоношения, размеры и форма макро- и микроконидий, наличие характерных мицелиальных структур, образование хламидоспор, формирование совершенных форм и т. д.). Многие возбудители дерматомикозов обладают выраженной потребностью в витаминах и на средах без витаминов образуют нетипичные колонии или вовсе не растут. В то же время на средах с высокой концентрацией глюкозы дерматофиты могут очень быстро подвергаться плеоморфным изменениям (исчезновение органов плодоношения), что делает невозможной в дальнейшем идентификацию данных грибов.

За рубежом в настоящее время для выделения грибов из патологического материала используют ряд стандартных коммерческих питательных сред. В нашей стране наибольшее распространение при микологических исследованиях получили агар Сабуро с глюкозой и сусло-агар. Последняя среда, однако, вследствие непостоянства ее химического состава, мало пригодна для идентификации патогенных грибов, хотя первичное выделение культур из патологического материала на этой среде в ряде случаев является целесообразным.

Серологические реакции

При большинстве микозов выраженность иммунологических изменений, происходящих в организме больных, очень незначительна. Поэтому для серологической диагностики грибковых заболеваний и тем более для выявления иммунной прослойки среди населения необходимы высокочувствительные иммунологические реакции. Именно поэтому в последние годы в медицинской микологии помимо классических серологических реакций агглютинации и связывания комплемента (7) стали широко применяться наиболее современные методы иммунологического анализа.

В качестве антигена для постановки серологических реакций в настоящее время используют обычно не фильтраты культуральной жидкости (типа трихофитии или гистоплазмина), а очищенные полисахаридные или белковые препараты. Эти диагностикумы обладают очень высокой активностью, а по специфичности значительно превосходят применявшиеся ранее антигены. Методы получения антигенных препаратов из возбудителей микозов подробно описаны А. И. Дроздовым (4). Следует указать однако, что ввиду наличия у ряда патогенных грибов общих антигенов даже наиболее очищенные препараты могут давать перекрестные реакции, что может послужить причиной диагностических ошибок.

Для постановки серологических реакций необходимо всегда использовать 0,85%-ный изотонический раствор хлористого натрия (физиологический раствор А ФР) а еще лучше забуференный физиологический раствор (ЗФР) с pH = 7,0 или 7,2. Учет результатов серологических реакций мы рекомендуем производить по трехбалльной системе: а) резко положительная реакция '( + + + +); б) положительная реакция ( + + ) ив) отрицательная реакция (—). Попытки более детальной («точной») оценки результатов реакции (+ ++, +, ±) необоснованы, т. к. возможность сравнения опытных пробирок с какими-либо эталонами отсутствует и в основу способа учета результатов серологических реакций положен субъективный принцип.

Применяющиеся в последние годы за рубежом различные инструментальные методы оценки результатов серологических реакций (нефелометры, люксметры, стандарты гемолиза для реакции связывания комплемента и др.) еще не получили, к сожалению, широкого распространения.

Можно рекомендовать производить постановку различных серологических реакций в их микромодификациях, которые в настоящее время хорошо разработаны в инфекционной иммунологии и широко применяются для диагностики различных бактериальных и вирусных инфекций. Постановка диагностических, реакций в микромодификациях имеет ряд серьезных преимуществ и не снижает чувствительности и специфичности метода, а напротив – нередко даже улучшает качество получаемых результатов.

Постановку серологических реакций в медицинской микологии производят, как правило, по обычным, принятым в инфекционной иммунологии методикам. Однако ввиду того, что для приготовления грибковых диагностикумов используются антигены, полученные специальными методами, технические детали реакций (концентрации растворов, порядок внесения ингредиентов, температура и длительность инкубации реагентов, состав используемых буферных растворов и др.) нередко могут отличаться от общепринятых. Вместе с тем только строгое соблюдение режима работы позволяет получить хорошие результаты при серологической диагностике грибковых заболеваний.

Реакция связывания комплемента (РСК) является весьма полезной при диагностике глубоких микозов – гистоплазмоза, кокцидиодомикоза и др. (6, 12, 15, 18). Однако положительная РСК наблюдается и при распространеных формах дерматомикозов (5, 7), при плесневых микозах (14), при споротрихозе (19), кандидозе. В то же время рядом авторов было показано, что. РСК дает отрицательные результаты у больных актиномикозом и споротрихозом (12). РСК ставят в объеме 1 мл (по 0,2 мл каждого ингредиента), причем связывание комплемента лучше производить при температуре +4° в течение 16-18 час. Т. М. Кокушина обращает особое внимание на правильность определения рабочей дозы комплемента и антигенов (7). Для стандартизации реакции и получения воспроизводимых результатов учет результатов РСК следует производить не только по мере наступления гемолиза в контролях соответствующих разведений сыворотки (при наличии гемолиза в контролях антигенов), но также спустя 1 час после возникновения гемолиза в исходном разведении сыворотки (1:5–1:10).

В микологических лабораториях США в последние годы для оценки результатов РСК используют стандарты гемолиза (от 0 до 100%, с интервалом в 10%), которые готовят, помещая эритроциты в растворы хлорида натрия различной концентрации. При отсутствии стандартов реакцию оценивают как резко положительную (полное отсутствие гемолиза, осадок эритроцитов на дне пробирки), положительную (неполная задержка гемолиза, большая часть эритроцитов не лизирована) или отрицательную (полный гемолиз или незначительная его задержка).

Реакция агглютинации (РА). Еще сравнительно недавно РА широко применялась для диагностики микозов и для изучения реакций иммунитета при дерматомикозах (5, 18,, 22), кандидозе (7, 15, 20), плесневых микозах (8, 11, 14) и некоторых глубоких микозах, при которых РА дает положительные результаты у большинства больных, иногда в сравнительно высоких титрах (6, 20, 22). Для постановки РА использовали живые или убитые (нагреванием, химическими веществами) клетки дрожжевых и дрожжеподобных грибов или измельченную грибницу мецилиальных грибов. Методика постановки РА при микозах сходна с методикой РА при бактериальных инфекциях. РА ставят в пробирках диаметром 0,5 см в обьеме 0,2-0,5 мл или на стеклянных пластинках, смешивая по одной капле исследуемой сыворотки и диагностикума. Учет результатов реакции производят с помощью вогнутого зеркала через 15-20 мин и через 1-2 часа. Реакцию считают резко положительной при наличии четкой крупнохлопьевой агглютинации в прозрачной жидкости, положительной – при четко видимой агглютинации на мутноватом фоне и отрицательной, если смесь исследуемой жидкости с диагностикумом остается гомогенно мутной. Параллельно с постановкой опыта ставят контроли с иммунной сывороткой, нормальной сывороткой и физиологическим раствором. Эта реакция является достаточно чувствительной, однако ввиду ее низкой специфичности и тенденции грибковых диагиостикумов к спонтанной агглютинации в последние годы РА при микозах применяется реже.

В то же время значительно шире стали использовать реакции, основанные на самом феномене агглютинации (склеивания) в присутствии противогрибковых антител инертных частиц (латекс, уголь, коллодий, бентонит, эритроциты и др.), предварительно сенсибилизированных специфическими грибковыми антигенами.

Реакция непрямой гемаглютинации (РНГА). Для постановки РНГА используют эритроциты человека или барана, покрытые растворимыми антигенами из патогенных грибов. Данный метод за последние 20 лет получил широкое распространение в инфекционной иммунологии, причиной чего является его исключительно высокая чувствительность и специфичность. Последнее обусловлено, по-видимому, тем, что для сенсибилизации эритроцитов используют очищенные антигены (10, 11, 14, 20), Для получения хороших результатов необходимо применять высококачественнные эритроцитарные диагностикумы. Ввиду отсутствия коммерческих препаратов кратко остановимся на методике их приготовления и схеме постановки РНГА.

Буферные растворы готовят из 0,158 М растворов КН2Р04 и Na2HP04. Состав буферных растворов: буфер 1 (pH = 7,2) 2 части раствора фосфата калия и 8 частей раствора фосфата натрия; буфер 2 (pH-5,0) – 98 частей раствора фосфата калия и 2 части раствора фосфата натрия. Эритроциты барана трижды отмывают ФР и готовят взвесь эритроцитов на буфере 1, разведенном ФР (при этом 1 мл осадка эритроцитов вносят в 33 мл разведенного буферного раствора). Танизацию эритроцитов производят равным объемом раствора танина 1 :20000 при 28° в течение 30 мин, дважды отмывают эритроциты буфером 1 и к осадку добавляют равный исходному объем ФР.

Сенсибилизацию эритроцитов производят при 37° в течение 1 часа, добавляя к 1 объему суспензии эритроцитов 4 объема буфера 2 и 1 объем 0,5%-ного раствора антигена. Параллельно для постановки контроля готовят партию несенсибилизированных эритроцитов. По окончании сенсибилизации эритроциты центрифугируют 5 мин при 3000 об/мин, отмывают дважды 0,5%-ным раствором нормальной кроличьей сыворотки, суспендируют в равном исходному объеме этого раствора, тщательно перемешивают и добавляют по 1 капле в пробирки, содержащие по 0,25 мл испытуемых сывороток в соответствующих разведениях. Пробирки энергично встряхивают и оставляют при комнатной температуре на 2 часа, после чего производят предварительный учет результатов реакции. Окончательную регистрацию производят на следующий день (пробирки хранят в холодильнике при +4°).

Оценку результатов РНГА производят по трехбалльной системе: а) резко положительная – резко выраженная агглютинация эритроцитов, осадок расположен равномерно По дну пробирки, образуя «зонтик» с тонким фестончатым краем; при встряхивании пробирки осадок разбивается на крупные глыбки агглютината, но при этом сыворотка остается абсолютно прозрачной; б) положительная реакция – осадок эритроцитов имеет хорошо выраженный край, который при покачивании пробирки отслаивается от ее стенок в виде пленки, а при встряхивании пробирок разбивается на мелкие глыбки; в) отрицательная реакция – плотный осадок эритроцитов на дне пробирки в виде «пуговки» или «кольца» с резко очерченным краем; при встряхивании пробирки происходит равномерное помутнение сыворотки. Учет результатов РНГА удобнее производить с помощью вогнутого зеркала в проходящем свете. Одновременно с постановкой опыта производят постановку положительного (с гомологичными иммунными сыворотками) и отрицательного (с несенсибилизированными эритроцитами) контролей.

Исследованиями ленинградских микологов (10, 11, 14) показана возможность получения высокоспецифичных эритроцитарных диагностикумов для выявления реакции иммунитета к возбудителям дерматомикозов (В. К. Грекова, 1968, Г. Н. Михеев и Н. А. Чайка, 1971), глубоких микозов (А. И. Дроздов, 1968), плесневых микозов (Н. А. Чайка, 1971). Эритроцитарные диагностикумы отличаются достаточной стабильностью при их хранении в холодильнике (+4°), но для получения более стойких препаратов рекомендуется использовать формалинизированные эритроциты. В настоящее время успешно ведется разработка лиофилизированных эритроцитарных диагиостикумов, которые сохраняют свою активность в течение нескольких лет и значительно удобнее для применения в практических лабораториях.

Реакция агглютинации латекса (РАЛ). Недостаточная стойкость эритроцитарных диагиостикумов привела к поиску других инертных носителей, способных сорбировать на своей поверхности иммунологически активные субстанции, которые позволили бы создать более стабильные диагностические препараты. Хорошие результаты были получены при сенсибилизации растворами грибковых антигенов частиц латекса, в результате чего удалось получить высококачественные препараты, пригодные для диагностики аспергиллеза, криптококкоза, гистоплазмоза, кокцидиоидомикоза и других грибковых заболеваний (11, 20, 22).

Для постановки РАЛ используют суспензию частиц латекса диаметром 0,8 мкм, которую разводят равным объемом борат- ного буфера (рН = 8,2) или глицинового буферного раствора (pH =8,2). К одному объему суспензии частиц латекса добавляют 4 объема раствора антигена в концентрации 2,5 мг/мл (1 :400) и выдерживают эту смесь 2 часа в термостате или на водяной бане при 37°. По окончании сенсибилизации суспензию частиц латекса центрифугируют в течение 5 мин при 3000 об/мин, надосадочную жидкость сливают, а осадок разводят равным исходному объемом боратного буфера. Разведения испытуемой сыворотки, кратные двум, готовят на том же боратном буфере. РАЛ ставят на стекле, добавляя к 2 каплям испытуемой сыворотки в соответствующем разведении по 1 капле суспензии нагруженных антигеном частиц латекса. Учет результатов РАЛ производят через 10—15 мин, оценивая ее так же, как и при постановке РА с корпускулярным грибковым антигеном. Параллельно ставят положительный (суспензия сенсибилизированных частиц латекса с гомологичной иммунной сывороткой) и отрицательные контроли (суспензия несенсибилизнрованного латекса и исходное разведение испытуемой сыворотки; суспензия несенсибилизированного латекса и нормальная сыворотка; суспензия сенсибилизированных частиц латекса и нормальная сыворотка).

Многочисленными исследованиями было установлено, что РАЛ по чувствительности и специфичности не только не уступает другим серологическим реакциям (РСК, РНГА), но и имеет ряд преимуществ. РАЛ может быть использована в полевых условиях и несомненно найдет широкое применение при целенаправленных эпидемиологических обследованиях для выявления глубоких микозов. Высокая чувствительность РАЛ будет способствовать ее внедрению и в клинических серологических лабораториях в качестве диагностического метода.

Реакция угольной агглютинации (РУА). Для приготовления антигенного диагностикума, который будет использован в РУА для выявления иммунной прослойки среди населения или для диагностики больных микозами, 1 г порошка активированного угля суспендируют в 15 мл ЗФР и помещают в фарфоровую ступку. К полученной взвеси приливают равный объем 1-2%-ного раствора антигена, приготовленного также на ЗФР.

Смесь тщательно растирают, переносят в центрифужный стакан и помещают в термостат или на водяную баню при 37° на 30 мин. По окончании сенсибилизации частиц угля смесь центрифугируют при 2500 об/мин в течение 10 мин, осадок промывают равным исходному объемом охлажденного до +4°ЗФР и затем сенсибилизированные частицы угля суспендируют в 30 мл 0,5%-ного раствора нормальной кроличьей сыворотки, приготовленного на ЗФР. Постановку РУА производят на стеклянных пластинках, на которые предварительно наносят по 2 капли испытуемых сывороток. К каждой сыворотке добавляют по одной капле угольной суспензии, перемешивают бактериологической петлей или запаянной пастеровской пипеткой и через 5-10 с производят учет результатов, оценивая интенсивность реакции по трехбалльной системе на основании выраженности аггломерата диагностикума. Можно использовать РУА и для выявления антигена в исследуемых субстратах — в этом случае сенсибилизацию частиц угля производят соответствующими иммунными сыворотками или их глобулиновыми фракциями. В литературе имеются сообщения об успешном применении РУА для диагностики криптококкоза, аспергиллеза и других висцеральных микозов.

Реакция преципитации (РП). Эта серологическая реакция достаточно хорошо изучена и широко применяется для диагностики микозов. В качестве антигена в РП используют обычно препараты типа кокцидиоидина или гистоплазмина или очищенные антигенные фракции грибов. РП становится положительной уже в начальных стадиях заболевания и поэтому ее используют для ранней диагностики микозов (6, 11, 12, 20). Особенно ценными являются ее высокая чувствительность и специфичность.

Ложноположительные результаты наблюдаются крайне редко, а простота постановки позволяет применять эту реакцию при обследовании больших коллективов и в полевых условиях.В последнее время РП нередко ставят в микромодификаций (в капиллярах), что повышает ее чувствительность и сокращает расход реагентов. Результаты реакции можно учитывать уже через 1-2 часа, хотя окончательную оценку лучше производить на следующий день (после инкубации в холодильнике при +4°). Реакцию считают резко положительной, если на дне пробирки обнаруживается плотный осадок, почти не разбивающийся при встряхивании, положительной — при наличии легких хлопьев агглютината и отрицательной при отсутствии осадка. Интенсивность реакции определяется последним разведением антигена, которое при смешивании с цельной исследуемой сывороткой дало образование осадка.

Реакция иммунодиффузии (РИД), или РП в агаровом геле, характеризуется еще большей специфичностью, чем РП, так как строго определенное расположение линий преципитации позволяет (при сравнении со стандартом) идентифицировать антигены, участвующие в реакции. Ложноположительные результаты при постановке РИД наблюдаются исключительно редко, а если и случаются, то могут быть легко дифференцированы от истинных положительных реакций (не смешивать с перекрестными реакциями, возникающими в результате антигенного родства возбудителей). РИД нашла широкое применение при эпидемиологических обследованиях на гистоплазмоз, бластомикоз и кокцидиоидомикоз (6, 19). Высокая чувствительность и специфичность РИД доказана как экспериментальными работами, так и многочисленными клиническими наблюдениями, причем не только при глубоких микозах, но и при дерматомикозах, кандидозах, плесневых микозах.

Для постановки РИД готовят на свежеприготовленном ФР агаровый гель в концентрации 1,25%; для этого лучше использовать агар «Дифко», при отсутствии которого можно применять специально обработанный обычный агар-агар (10). К агару добавляют 1%-ный раствор мертиолята в соотношении 1:100. Для постановки РИД используют предметные стекла или отмытые от эмульсии фотопластинки, которые предварительно тщательно моют и обезжиривают кипячением или смесью спирта с эфиром. С помощью пипетки расплавленный агар осторожно наливают на поверхность установленного строго горизонтально стекла (на предметное стекло 2,5x7,5 см – 3 мл, на фотопластинку 9x12 см – 18 мл агара). Сразу же после застывания агара пластинки помещают во влажную камеру, в качестве которой можно использовать чашки Петри, плотно закрытые фотокюветы или стеклянные банки.

Специальным пробойником по заранее приготовленному трафарету в толще агара вырезают лунки, содержимое которых удаляют пастеровской пипеткой, присоединенной к вакуум-насосу. Лунки удобнее располагать группами по 7 штук: одна в центре – для антигена и 6 лунок вокруг – для сывороток. Расстояние между лунками и диаметр самих лунок подбирают опытным Путем в каждом конкретном случае (обычно оптимальный диаметр лунок 3-5мм, расстояние между ними – 4-7мм). Затем соответственно предварительно подготовленной схеме с помощью пастеровских пипеток (отдельная пипетка для каждой сыворотки и каждого антигена) ингредиенты реакции вносят в лунки. При постановке реакции с сыворотками больных антиген используют в разведении 1 :500 – 1 :1000, а сыворотки берут в реакцию неразведенными.

В случае положительной реакции в дальнейшем производят титрование сыворотки от 1 :2 до 1 :32 – 1 :64. При постановке РИД в микромодификации диаметр центральной лунки для антигена составляет 2 мм, диаметр периферических лунок для исследуемых сывороток – 1 мм.

Пластинки с заполненными лунками помещают во влажную камеру и оставляют при комнатной температуре на ночь, а затем хранят в холодильнике при +4°. Учет результатов реакции производят ежедневно в течение 3-4 дней, отмечая появление линий преципитации на специальной Схеме разноцветными карандашами (соответственно срокам появления линий). Одновременно с постановкой опыта ставят положительный (используемый в реакции антиген с гомологичной иммунной сывороткой) и отрицательный (испытуемые сыворотки с изотоническим раствором хлористого натрия) контроли.

Иммуноэлектрофорез (ИЭФ). Метод ИЭФ, основанный на свойстве антигенов и антител перемещаться в постоянном электрическом поле в определенном направлении с определенной скоростью, вначале использовался исключительно для целей иммунохимического анализа. Однако к настоящему времени накоплено значительное количество данных, указывающих на возможность диагностического применения метода ИЭФ. Так же, как и РИД, метод ИЭФ отличается исключительно высокой специфичностью и при положительных результатах с несомненностью указывает на наличие специфической грибковой инфекции (или грибковой сенсибилизации). Французскими исследователями выявлена диагностическая ценность метода ИЭФ при аспергиллезе, кандидозе, споротрихозе, мицетомах, при микотической сенсибилизации и других микозах.

Электрофоретическое разделение антигенов производят в 1,5%-ном агаровом геле, приготовленном на веронал-мединаловом или мединал-солянокислом буферном растворе с pH-8,2. Стеклянные пластинки с агаровым гелем готовят для ИЭФ так же, как и для РИД. По специальному трафарету в геле пробойником вырезают лунки для антигенов, агар из которых удаляют. Оспопрививочным пером делают продольные прорези будущих траншей для сывороток, но агар из них не удаляют. Лунки заполняют отобранными для опыта антигенами в концентрации 5-20 мг/мл; растворы антигенов готовят на том же буфере.

Аппарат для электрофореза должен быть полностью готов к работе к моменту заполнения лунок растворами антигенов. Источник питания готовится к работе согласно инструкции. Скорость подачи буферного раствора – около 3-5 мл/мин в каждую ванночку, в которую опущен электрод; охлаждение стекла производят проточной водопроводной водой. Сразу же после заполнения лунок антигенами пластинки помещают в камеру для электрофореза, В качестве мостов между буферным раствором электродной ванночки и агаровым гелем используют полоски хроматографической бумаги.

Электрофорез производят при градиенте потенциала 5-6 В/см при силе тока 25-35 миллиампер длительность электрофореза составляет 2-3 часа. Каждый опыт с сыворотками больных сопровождается постановкой положительного контроля с гомологичным испытуемым антигенам иммунными сыворотками. По окончании электрофореза агар из траншей удаляют и их заполняют неразведенными испытуемыми сыворотками., Стекла помещают во влажную камеру и учет результатов ведут так же, как и при РИД.

Реакция  иммунофлуоресценции (РИФ). Диагностические возможности РИФ при микозах достаточно полно изложены в совместной польско-советской монографии «Иммунофлюоресценция» (под ред. Ю. Ф. Кубицы. М., «Медицина», 1967) и в ряде других изданий. РИФ дает хорошие результаты при диагностике кокцидиодомикоза, гистоплазмоза, бластомикоза, споротрихоза, кандидоза, криптококкоза, нокардиоза. Метод чувствителен, специфичен и при достаточном навыке работы позволяет исследовать большое количество препаратов. При наличии централизованного выпуска специфических меченых сывороток РИФ может быть с успехом использована для экологических и широких эпидемиологических изысканий.

Для обнаружения антигенов патогенных грибов могут быть использованы два варианта РИФ – прямая и непрямая реакции. При окрашивании препаратов прямым методом на мазок наносят каплю конъюгата (специфическая иммунная сыворотка, меченная изотиоцианатом флюоресцеина), приготовленного в рабочей дозе, и стекло инкубируют во влажной камере при 37° в течение 15-20 мин. Затем препарат промывают (мазки, приготовленные из взвеси культур гриба – 20 мин в проточной водопроводной воде; мазки из патологического материала промывают дважды по 10 мин в ЗФР и ополаскивают дистиллированной водой), наносят на них каплю дистиллированной воды закрывают покровным стеклом и микроскопируют с помощью люминесцентного микроскопа. Микроорганизмы, гомологичные примененному для окрашивания конъюгату, дают ярко-зеленое свечение. Интенсивность специфической флуоресценции оценивают по четырехбалльной системе: ( + + + + ) – сверкающая флуоресценция ярко-зеленого цвета с четко выявляемыми морфологическими особенностями окрашенных структур; ( + + +) – яркая специфическая флуоресценция с хорошо выявляемыми цветом и морфологическими особенностями окрашенных антигенных структур; (++) – выраженная специфическая флуоресценция с отчетливо выявляемым цветом и морфологическими особенностями клеток грибов; (+) – заметная, но слабо выраженная специфическая флуоресценция с неотчетливо выявляемым цветом; морфологические особенности окрашенных клеток различаются нечетко.

При окрашивании препаратов непрямым методом для обнаружения антигена одновременно с приготовлением мазков из патологического материала готовят два контрольных мазка из культуры возбудителя, гомологичного иммунной сыворотке. На один контрольный и все остальные мазки наносят каплю немеченой иммунной сыворотки или глобулина в рабочей дозе. На второй контрольный мазок наносят каплю нормальной сыворотки того вида животного, от которого использована антисыворотка.

Инкубацию во влажной камере и последующую промывку производят так же, как и при окраске препаратов прямым методом. Затем на каждый мазок наносят каплю меченого диагностикума против глобулина TOFO вида животного, которое было использовано для получения иммунной сыворотки. Препараты инкубируют во влажной камере при 37° в течение 15-20 мин, промывают и микроскопируют так же, как и при прямой РИФ.
В отрицательном контроле клетки не должны светиться. Непрямая РИФ может быть использована при проведении экологических исследований и эпидемиологической разведки для выявления патогенных грибов во внешней среде (в почве, воде, воздухе).

Для обнаружения антител используют непрямую РИФ. При этом готовят 3 мазка из культуры возбудителя, гомологичного антителам, которые предполагают обнаружить. Один мазок обрабатывают неизвестной испытуемой сывороткой, второй (положительный контроль) – иммунной сывороткой, гомологичной использованной культуре, и третий (отрицательный контроль) – нормальной сывороткой от того же вида животного.

В случае исследования сывороток от больных людей контрольные мазки также обрабатывают человеческой сывороткой. Мазки инкубируют при 37° во влажной камере в течение 15-20 мин и затем промывают 20 мин в проточной воде, после чего микроскопируют так же, как и при прямом методе РИФ. Присутствие антител определяют по наличию специфической флуоресценции клеток в положительном контроле и в опытном препарате; в отрицательном контроле не должно быть светящихся клеток. При необходимости количественного определения антител их титр может быть установлен в повторном опыте с серией двухкратных последовательных разведений данной сыворотки.

Аллергические тесты применяют для выявления иммунологических изменений в организме больных микозами, для определения течения заболевания и для оценки эффективности проводимого специфического лечения. Кроме того аллергические тесты постоянно используют для массовых эпидемиологических обследований и для определения границ эндемичных очагов – в комплексе с экологическими и серологическими исследованиями. При этом чаще всего применяют внутрикожный метод введения аллергена (с помощью туберкулинового шприца). В качестве аллергенов чаще используют фильтраты жидкой питательной среды, в которой в течение длительного времени выращивали соответствующие патогенные грибы, а в последнее время – и очищенные антигенные и аллергенные фракции полисахаридной и белковой природы (4, 19). При внутрикожном методе вводят 0,02-0,1 мл раствора антигена; результаты реакции учитывают через 15-20 мин (аллергия немедленного типа) и через 24 и 48 час (реакции замедленного типа). Скарификационные и накожные аллергические тесты в микологии применяют редко.

В последнее десятилетие для выявления микотической сенсибилизации значительно шире стали использовать аллергические тесты инвитро – реакцию бластоидной трансформации лимфоцитов больного под влиянием специфического аллергена, реакцию лейкоцитолиза – определение показателя повреждаемости полинуклеаров при инкубации последних с гомологичным грибковым аллергеном (9, 14). Эти тесты исключают возможность развития анафилактоидных реакций при обследовании людей с очень высокой степенью микотической гиперсенсибилизации.

Биологический метод. Для выявления возбудителей глубоких микозов в образцах почвы или патологическом материале помимо культурального и серологического (РИФ) методов используют также заражение восприимчивых лабораторных животных (чаще золотистые хомячки или белые мыши).Спустя 3–4 недели животных забивают и исследуют их внутренние органы с помощью микологических и гистологических методов (6, 9, 12, 19). Биологический метод очень чувствителен, однако его трудоемкость и сравнительно высокая стоимость лабораторных животных препятствуют широкому внедрению этого метода в эпидемиологическую практику.