Осадочная реакция Кана
Для постановки реакции Кана требуется специальный антиген (антиген Кана), представляющий собой экстракт липоидов из мышц бараньего сердца, к которому добавлен холестерин. Этот антиген выпускается в ампулах емкостью 10 мл и сохраняется в темном месте при комнатной температуре. На этикетках указан титр антигена (1+1; 1 + 1,1; 1 +1,2) и срок его годности.
В зависимости от титра, указанного на этикетке, антиген разводят следующим образом. В одну чистую и сухую пробирку наливают антиген, а в другую — физиологический раствор в количестве, указанном на этикетке (1; 1,1; 1,2 мл). Затем физиологический раствор из второй пробирки быстро выливают в первую, содержащую антиген (а не наоборот!). Полученную смесь размешивают, переливая ее из пробирки в пробирку 6-8 раз, и оставляют на 10 минут при комнатной температуре для созревания.
Для каждой исследуемой сыворотки берут по три пробирки, на дно которых микропипеткой вносят разное количество антигена, разведенного по титру: в пробирку № 1 — 0,05 мл, в пробирку № 2 — 0,025 мл и в пробирку № 3 — 0,0125 мл (в пробирки нужно сначала вливать антиген). Микропипетка с антигеном должна быть опущена на дно сухой пробирки — этим достигается точность отмеривания антигена. Затем во все пробирки добавляют по 0,15 мл испытуемой сыворотки. Встряхивают 3 минуты и доливают физиологический раствор: в пробирку № 1 — 1 мл, в пробирки № 2 и 3 — по 0,5 мл, после чего их повторно встряхивают. Параллельно ставят контроли исследуемых сывороток и антигена (см. табл. 8).
Для контроля сыворотки в пробирку наливают 0,1 мл сыворотки и добавляют 0,3 мл физиологического раствора; после трехминутного встряхивания в пробирке не должны выпадать хлопья. Для контроля антигена в пробирки с антигенами добавляют по 0,15 мл физиологического раствора. Реакция протекает при комнатной температуре, и резуль¬таты ее учитываются после добавления физиологического раствора невооруженным глазом, при помощи лупы или агглютиноскопа.
При учете реакции невооруженным глазом каждую пробирку вынимают из штатива и, слегка наклонив, держат несколько выше уровня глаз перед источником света.
При учете агглютиноскопом поступают так: исследуемую пробирку помещают в горизонтальную трубку (2) и, наблюдая в окуляр (1), регулируют полотенца шторки и зеркала (3, 4), таким образам, чтобы отраженные от зеркала лучи света, проходя через жидкость, позволяли видеть хлопья агглютинации. После этого окуляр устанавливают по своему глазу (рис. 77).
Рис. 77. Агглютиноскоп.
Выпадение хлопьев (преципитата) в пробирках с исследуемой сывороткой служит показанием положительной реакции Кана и обозначается плюсами. Резко положительная реакция обозначается четырьмя плюсами (+ + + + ); для нее характерно выпадение ясно видимых хлопьев во всех пробирках и слегка опалесцирующей жидкости. Положительная реакция обозначается тремя плюсами (+ + +) и характеризуется менее отчетливо выраженным выпадением хлопьев во всех пробирках. Для слабо положительной реакции, обозначаемой двумя плюсами (++), характерно более слабое образование осадка и наличие мелких частичек в мутноватой жидкости. Образование очень мелких взвешенных частичек в мутноватой жидкости обозначают одним плюсом ( + ). Отсутствие осадка и свободно взвешенных частиц в жидкости является показателем отрицательной реакции и обозначается минусом (—). Все контрольные пробирки не должны давать хлопьев.
Согласно инструкции, реакцию Кана можно ставить в одной пробирке для каждой испытуемой сыворотки со средней дозой антигена, т. е. равной 0,025 мл.
В агглютинационную пробирку отмеривают микропипеткой 0,025 мл разведенного по титру антигена Кана. После 10-минутного созревания антигена добавляют 0,15 мл инактивированной исследуемой сыворотки и 3 минуты встряхивают. Затем добавляют 0,5 мл физиологического раствора, снова встряхивают в течение 2 минут и учитывают результаты реакции. Учет можно производить в течение первых 20 минут. При постановке реакции обязательно ставят контрольную пробирку, в которой к антигену вместо сыворотки добавлен 0,15 мл физиологического раствора.
При постановке реакции Кана желательно ставить контроли с заведомо положительной и отрицательной сыворотками.
