Реакция Вассермана

Реакция Вассермана основана на взаимодействии антител, содержащихся в иммунной сыворотке, со специфическим антигеном при обязательном участии комплемента.

Соединение антигена с антителом и связывание комплемента происходят невидимо для невооруженного глаза. Для определения, связался ли комплемент или остался свободным, в качестве индикатора при постановке реакции вводят гемолитическую систему.

В том случае, когда исследуемая сыворотка содержит специфические для антигена антитела, комплемент будет связан с комплексом антиген — антитело и при добавлении гемолитической системы гемолиза эритроцитов не произойдет. Реакция будет считаться положительной (см. рис. 74 и схему 1).

Если же исследуемая сыворотка не содержит специфических антител, т. е. антиген и антител не соответствуют друг другу, комплемент остается свободным и при добавлении гемолитической системы произойдет гемолиз (растворение) эритроцитов в результате присоединения комплемента к гемолитической системе. Реакция будет считаться отрицательной (см. рис. 75 и схему 1).

Рисунки 74 и 75. Гемолиз эритроцитов отсутствует и полный гемолиз эритроцитов.

Схема 1. Схема реакции связывания комплемента.

Для проведение данных исследований необходимо следующее оснащение рабочего места:

1. Штатив с пробирками.
2. Микропипетки.
3. Градуированные пипетки на 1,5 и 10 мл.
4. Физиологический раствор.
5. 3% взвесь эритроцитов барана.
6. Гемолитическая сыворотка.
7. Комплемент.
8. Три антигена для реакции Вассермана, из которых один кардиолипиновый.
9. Сыворотка крови больного человека.
10. Сыворотка крови заведомо здорового человека (заведомо отрицательная сыворотка).
11. Сыворотка крови заведомо больного сифилисом человека (заведомо положительная сыворотка).

Демонстрация постановки реакции Вассермана

Перед постановкой опыта необходимо произвести следующую подготовительную работу:

1. Инактивируют сыворотку крови больного человека, т. е. лишают собственного комплемента. Это достигается путем нагревания ее на водяной бане при температуре 56-58° в течение 30 минут.
2. Инактивированные сыворотки разводят физиологическим раствором в соотношении 1 : 5, т. е. к 1 мл сыворотки добавляют 4 мл физиологического раствора.
3. Готовят гемолитическую систему, состоящую из равных частей гемолитической сыворотки и 3% взвеси эритроцитов барана. Гемолитическая сыворотка выпускается в запаяиных ампулах. На каждой ампуле имеется этикетка, где указан титр сыворотки. Перед постановкой опыта ампулу вскрывают и сыворотку разводят физиологическим раствором в 3-4 раза меньше титра, указанного на этикетке ампулы (т. е. до ее тройного титра). Так, например, если титр гемолитической сыворотки равен 1: 1200, то сыворотка должна быть разведена в физиологическом растворе в соотношении 1:300 или 1 :400, т. е. к 0,1 мл гемолитической сыворотки добавляют до 30-40 мл физиологического раствора.

Приготовляют 3% взвесь барана, для чего берут кровь у барана путем пункции яремной вены в стерильную посуду с бусами. Кровь дефибринируют и фильтруют через двойной слой стерильной марли, чтобы освободить ее от сгустков выпавшего фибрина.

Профильтрованную кровь разливают по центрифужным пробиркам и центрифугируют. Полученный верхний слой сыворотки отсасывают пипеткой, а осевшие на дно эритроциты 3 раза промывают физиологическим раствором, каждый раз добавляя физиологический раствор до первоначального объема, и центрифугируют. Последняя порция надосадочной жидкости будет совершенно бесцветной. Отмытые эритроциты можно сохранять в холодильнике при температуре от 2 до 4°. В этих условиях эритроциты сохраняются от 3 до 6 дней. При наступлении гемолиза эритроцитов ими пользоваться нельзя.

3% взвесь эритроцитов для опыта приготовляют из отмытых эритроцитов. Для этого к 3 мл отмытых эритроцитов добавляют 97 мл физиологического раствора. Категорически запрещается обработка эритроцитов дистиллированной водой, так как при этом происходит самопроизвольный (спонтанный) гемолиз. Исходя из этой пропорции, можно готовить необходимое количество 3% взвеси эритроцитов барана.

Гемолитическую сыворотку приливают к взвеси эритроцитов барана (а не наоборот) и ставят в термостат на 30 минут при 37° для сенсибилизации эритроцитов (т. е. для повышения их чувствительности к действию комплемента).

В гемолитической системе эритроциты барана должны растворяться только в присутствии комплемента. Если гемолиз наступил самостоятельно без комплемента, то такую гемолитическую сыворотку нельзя вводить в опыт.
Если для опыта необходимо приготовить 10 мл гемолитической системы, то поступают так: в колбочку наливают 5 мл 3% взвеси эритроцитов барана и к ней добавляют 5 мл гемолитической сыворотки, разведенной до ее тройного титра (см. выше).

4. Разводят антигены по титру. Согласно существующим инструкциям, применяют три антигена (№ 1, 2 и 3 — кардиолипиновый). Все они являются спиртовыми экстрактами липоидов из мышц бычьего сердца.
Антигены выпускаются специальными институтами в запаянных ампулах емкостью 5-10 мл, которые следует хранить при температуре от 15 до 18°, и пригодны для работы в течение одного года после их выпуска. При выпадении кристаллов холестерина антиген следует прогреть в водяной бане при температуре 55-56° или в термостате при температуре 37° до растворения кристаллов. На каждой ампуле с антигеном указан номер серии, титр антигена и способ его разведения (быстрый или медленный).

Для работы ампулу разбивают, антиген переливают в сухую и чистую пробирку и закрывают тугой корковой (но не резиновой) пробкой. Кардиолипиновый антиген надо разводить быстро, причем после разведения он должен быть слегка опалесцирующим, но не мутным.

Титром антигена обозначается то его количество, которое должно находиться в 1 мл физиологического раствора и которое не задерживает гемолиза при наличии гемолитической системы и комплемента. Так, например, если на ампуле указап титр антигена 0,05 мл, то это значит, что к 1 мл физиологического раствора следует прибавить 0,05 мл антигена.

5. Титруют комплемент в чистом виде, в присутствии антигенов и определяют его рабочую дозу. Комплементом служит сыворотка крови морской свинки, которая может применяться свежей, консервированной или в виде сухого порошка (сухой комплемент). Свежеполучепный или консервированный комплемент перед опытом разводят физиологическим раствором в соотношении 1 : 10 — 1 мл комплемента + 9 мл физиологического раствора.

При пользовании сухим комплементом содержимое одной ампулы, равное 0,5 мл свежей сыворотки, разводят в 5 мл физиологического раствора.

Определение титра комплемента в чистом виде

В штатив ставят 13 пронумерованных пробирок, из которых три последние (№ 11, 12 и 13) служат контролем.
В первые 10 пробирок (от № 1 до 10) микропипеткой разливают разведенный 1:10 комплемент в постепенно повышающихся дозах — от 0,05 до 0,5 мл, как это видно из приведенной ниже схемы (табл. 4).

Затем в каждую из 10 пробирок добавляют физиологический раствор до 1,5 мл. В пробирку № 11 наливают 0,5 мл комплемента в разведении 1: 10 и 1,5 мл физиологического раствора, в пробирку № 12 — 1,5 мл физиологического раствора и в пробирку № 13 — 2 мл физиологического раствора. После этого все пробирки встряхивают и ставят на один час в термостат при температуре 37°.

Через час стояния в термостате штатив с пробирками вынимают и доливают в них — с № 1 по № 10 по 1 мл гемолитической системы. В пробирки № 11 и 13 доливают по 0,5 мл 3% взвеси эритроцитов барана и в пробирку № 12 — 1 мл гемолитической системы. Все пробирки снова энергично встряхивают и ставят в термостат при температуре 37° на один час, после чего учитывают результаты опыта, т. е. учитывают пробирки, в которых произошел гемолиз. Наименьшее количество комплемента, растворившее взвесь сенсибилизированных эритроцитов барана, считается его титром.

В контрольных пробирках № 11, 12 и 13 гемолиз не должен произойти, так как в пробирке № 11 отсутствует гемолитическая сыворотка, в пробирке № 12 — комплемент и в пробирке № 13 нет комплемента и гемолитической сыворотки. Если в контрольных пробирках наступит гемолиз эритроцитов, то опыт считается недействительным. В табл. 4 приведена примерная схема титрования комплемента в чистом виде.

Титрование комплемента в присутствии антигенов

Техника титрования комплемента, как видно из приведенной ниже схемы (табл. 5), заключается в следующем.
В большой штатив устанавливают три ряда по семь нумерованных пробирок (с № 1 по № 7) в каждом ряду. Во все пробирки каждого ряда, пользуясь одной микропипеткой, разливают комплемент в разведении 1: 10 в дозах от 0,2 до 0,05 мл. Затем во все пробирки доливают физиологический раствор, чтобы общее количество жидкости (комплемент + физиологический раствор) составляло 1 мл.

После этого отдельными пипетками для каждого антигена в семь пробирок первого ряда добавляют по 0,5 мл антигена № 1, разведенного по титру, в пробирки второго ряда — по 0,5 мл антигена № 2 и в пробирки третьего ряда — по 0,5 мл антигена № 3. Пробирки хорошо встряхивают и помещают в термостат при температуре 37° на один час.

По истечении часа штатив с пробирками вынимают из термостата и во все пробирки доливают по 1 мл гемолитической системы. Смесь встряхивают и штатив с пробирками ставят снова в термостат на один час, после чего учитывают результаты опыта, т. е. определяют то минимальное количество комплемента, которое в присутствии антигена дает гемолиз.

При постановке реакции Вассермана применяют так называемую рабочую дозу комплемента. Рабочая доза составляет титр комплемента + надбавка 15—30%. Например, если титр комплемента в чистом виде равняется 0,2 мл, то рабочая доза его будет 0,23—0,26 мл.

Если при титровании комплемента с различными антигенами устанавливаются различные рабочие дозы комплемента, то в реакции Вассермана следует применять рабочую дозу комплемента, соответствующую каждому антигену в отдельности.

Техника постановки реакции Вассермана

Реакция Вассермана ставится в общем объеме 2,5 мл; каждый из ингредиентов берется в объеме 0,5 мл. Штатив заполняют пробирками из расчета четыре пробирки на каждую исследуемую сыворотку, причем на первой из них отмечают номер исследуемой сыворотки. Во все четыре пробирки наливают по 0,1 мл инактивированной сыворотки, после чего в первые три пробирки доливают 0,4 мл свежеприготовленного физиологического раствора, в четвертую, контрольную, — 0,9 мл физиологического раствора.

В первые три пробирки доливают по 0,5 мл разведенного антигена (в первую пробирку — антиген № 1, во
вторую — антиген № 2 и в третью — антиген № 3), после чего во все пробирки добавляют по 0,5 мл комплемента, разведенного по рабочей дозе, установленной предварительным титрованием комплемента. Так поступают с каждой исследуемой сывороткой. По этому же способу проверяют и две контрольные сыворотки (заведомо положительная и заведомо отрицательная). Каждую сыворотку и каждый антиген разливают отдельными пипетками.

Штатив с пробирками хорошо встряхивают и ставят в термостат при температуре 37° на один час. После часового стояния в термостате пробирки вынимают и в каждую из них доливают по 1 мл гемолитической системы. Затем их вновь хорошо встряхивают и помещают в термостат еще на 40 минут в зависимости от гемолиза в контрольных пробирках: если в них гемолиз наступит раньше, то штатив с пробирками вынимают раньше и учитывают результаты опыта.

Если по истечении 40 минут результат будет сомнительным, то штатив с пробирками оставляют в леднике или в прохладном месте до следующего дня и производят повторный учет результатов.

Степень задержки гемолиза отмечают плюсами (рис. 76):

• полное отсутствие гемолиза — (+ + + + ) (жидкость над эритроцитами бесцветна — эритроциты осели в осадок);
• ясная задержка гемолиза — (+ + +) (надосадочная жидкость красноватого цвета, эритроциты в осадке; некоторое покраснение надосадочной жидкости обусловлено частичным гемолизом эритроцитов);
•  частичная задержка гемолиза — (++) (надосадочная жидкость красная за счет более резкого гемолиза эритроцитов, часть эритроцитов в осадке);
• следы задержки гемолиза (надосадочная жидкость красная, на дне незначительный осадок из эритроцитов) .

Рисунок 76. Степень задержки гемолиза при реакции Вассермана.

Полный гемолиз — все эритроциты полностью гемолизировались — обозначается знаком минус (—).

Показателем правильности постановки опыта будет наличие полного гемолиза во всех пробирках с заведомо отрицательной сывороткой, а также задержка гемолиза на + + + +, + + + или + + в первых трех пробирках с заведомо положительной сывороткой. Полный гемолиз будет также в каждой четвертой пробирке. Схему постановки основного опыта реакции Вассермана и учета результатов проведения см. табл. 6.

У больного сифилисом реакция Вассермана будет положительной, т. е. его сыворотка будет давать выраженную в разной степени задержку гемолиза.