Макро- и микроскопическое исследование ликвора

Для проведения данных исследований необходимо следующее оснащение рабочего места:

1. Смесители для лейкоцитов.
2. Пастеровские пипетки.
3. Камеры Фукса-Розенталя и камеры Горяева со стеклами к ним.
4. Шпатели и иглы.
5. Центрифуга.
6. Предметные и покровные стекла.
7. Микроскоп.
8. Метилвиолет (генцианвиолет).
9. Фуксин.
10. Фенол.
11. Концентрированная уксусная кислота.
12. Дистиллированная вода.
13. Фиксатор Май-Грюнвальда.
14. Краска Романовского.
15. Азур II.
16. Эозин.
17. Эозин желтый.
18. Двузамещенный фосфорнокислый натрий.
19. Однозамещенный фосфорнокислый калий.

Рис. 62. Сетка камеры Фукса-Розенталя.

Определение физических свойств ликвора

Количество ликвора устанавливают на глаз в пробирках, в которых он был доставлен в лабораторию.
Цвет и прозрачность ликвора определяют путем сравнения с дистиллированной водой (для этого ликвор и дистиллированную воду наливают в две пробирки одинакового диаметра).

Отмечают макроскопические примеси (фибринозные пленки, кровяные сгустки и др.).

Микроскопическое исследование ликвора

Подсчет клеточных элементов

Количество клеток в лик воре (цитоз) подсчитывают тотчас после получения жидкости, для чего используют камеру Фукса-Розенталя или Горяева. В смеситель для лейкоцитов набирают до метки 1,0 раствор Самсона: 30 мл ледяной уксусной кислоты, 2 мл карболовой кислоты (насыщенный раствор фенола), 2 мл спиртового раствора фуксина 1 : 100, дистиллированной воды до 100 мл.

После взятия реактива кончик смесителя вытирают и его кладут на стол в горизонтальном положении. Ликвор в пробирке перемешивают в течение 2-3 минут, вращая пробирку между ладонями, после чего набирают в смеситель с краской до метки 11. Для окрашивания клеточных элементов смеситель оставляют на 2-3 минуты и подготавливают камеру Фукса-Розенталя (рис. 62) пли Горяева. Затем смеситель встряхивают, 2-3 капли жидкости выпускают на фильтровальную бумагу и последующей каплей заполняют камеру. Подсчет форменных элементов производят при опущенном конденсоре микроскопа (окуляр 7Х, объектив 40Х). Клеточные элементы сосчитывают на всей площади сетки камер. Рекомендуется сосчитать две камеры и вывести среднее.

При использовании камеры Фукса-Розенталя (см. рис. 62) (площадь сетки 16 мм2, глубина 0,2 мм, объем 3,2 м , разведение 11: 10) число элементов в 1 мм3 выражают формулой:

Число элементов в 1 мм3 = число элементов на площади сетки х 11/32.

При получении ликвора в небольшом количестве пастеровской пипеткой отмеривают 10 капель исследуемой жидкости и каплю краски, смешивают их на часовом стекле, а затем заполняют камеру. При значительном содержании клеток - плеоцитозе (более 200 на площади сетки) сосчитывают половины сетки камеры Фукса-Розенталя, полученный результат удваивают и рассчитывают как обычно. При плеоцитозе более 1000 подсчитывают первый ряд больших квадратов сетки и полученный результат умножают на 4 и т.д.

В норме имеется от 1 до 3 экземпляров лимфоцитов в 1 мм3.

Цитологическое исследование

Цитологическое исследование сводится к распознаванию клеточных элементов ликвора, что лучше всего достигается в окрашенных препаратах.

Техника окраски препаратов. Препараты для микроскопического исследования готовят из клочков, фибринозных свертков и из отцентрифугированного осадка. Вначале изучают нативные препараты. Для этого препарат накрывают покровным стеклом и изучают под микроскопом при большом увеличении следующим образом: снимают покровное стекло, материал равномерно распределяют по поверхности предметного стекла; мазок высушивают, фиксируют и окрашивают по Романовскому. Так как элементы ликвора легко окрашиваются, готовят более слабое разведение краски Романовского — 1-2 капли на 5 мл воды — и красят 15-20 минут. Морфологические особенности клеточных элементов хорошо выявляются при окраске их по методу С. Б. Ро- зиной.

Доставленный ликвор центрифугируют 5 минут при 3000 об/мин. Отцентрифугированную жидкость переливают в пробирку для химических исследований. Оставшийся в центрифужной пробирке осадок встряхивают и переносят каплю его на обезжиренное предметное стекло. Слегка покачивая стекло, капле дают равномерно распределиться на поверхности последнего. Таким образом, для приготовления мазка не используют шлифованное стекло во избежание малейшей травмы и деформации клеток.

Если цитоз небольшой (менее 50 клеток в 3 мм3), весь осадок распределяют на небольшом участке стекла, приблизительно 1 см2. При цитозе, превышающем 100 клеток в 3 мм3, осадок равномерно распределяют по предметному стеклу на участке 1,5-2 см2. При цитозе более 500 клеток в 3 мм3 осадок распределяют по предметному стеклу на площади 2-3 см2 и через 1-2 минуты сливают. За это время форменные элементы оседают на стекле и образуют равномерный тонкий слой. При обилии клеточных элементов — 1000 и более в 3 мм3 — или при наличии крови в спинномозговой жидкости осадок распределяют по всей поверхности предметного стекла и тотчас же сливают.

После этого стекло на 5-10 минут устанавливают почти вертикально, чем достигается минимальная толщина мазка. Далее препарат высушивают 10-15 минут при температуре 40-50° и фиксируют метиловым спиртом: 2-3 капли метилового спирта наливают на мазок и оставляют на стекле до полного высыхания (приблизительно 3-5 минут). Приготовление препарата, его высушивание и фиксацию удобно проводить в сушильном шкафу. Предварительно пронумерованные стекла раскладывают рядами в сушильном шкафу и осадки из центрифужных пробирок наливают на стекло с соответствующим номером. Препараты с очень большим цитозом размещают в сушильном шкафу отдельно, готовя из них мазок, как описано выше. После фиксации препараты окрашивают.
Реактивы, необходимые для окраски:

1. Азур II — 1 г азура растворяют в 1 л дистиллированной воды.
2. Эозин желтый — 1 г эозина растворяют в 1 л дистиллированной воды.
3. Буферная смесь с рН 7,0.

Буферную смесь готовят следующим образом: 3,2 г двуосновного фосфорнокислого натрия (Na2HP04) и 1,63 г одноосновного фосфорнокислого калия (КН2РО4) растворяют в 1 л дистиллированной воды. Буферную смесь следует хранить на холоду (при температуре 4°) или консервировать добавлением нескольких кристаллов тимола. Перед окраской смешивают 3 мл раствора азура II и 2 мл раствора желтого эозина в 25 мл раствора буферной смеси.

Приготовленные из осадка ликвора и фиксированные препараты заливают краской на 6-12 минут. Препараты, приготовленные из ликвора с небольшим цитозом, следует красить 6-7 минут, а с цитозом выше 1000 клеток в
3 мм3 или с примесью крови — 10-12 минут. После окраски препараты смывают дистиллированной водой, устанавливают в штатив и высушивают в сушильном шкафу.

В окрашенных препаратах неизмененные форменные элементы спинномозговой жидкости имеют такой же вид, как в мазках крови, окрашенных по способу Романовского, т. е. ядра клеток фиолетового цвета, цитоплазма нейтрофилов розоватая, лимфоцитов и полибластов голубая, зернистость эозинофилов оранжево-красная. Если ядра клеток имеют голубоватый оттенок, то продолжительность окраски препарата следует увеличить на 1-2 минуты.

В таких мазках возможен подсчет клеточных элементов в процентах (морфологию лейкоцитов и технику подсчета их в мазке).

В окрашенных препаратах из ликвора обнаруживают нейтрофилы, эозинофилы, лимфоциты, моноциты, плазматические клетки, по морфологическим признакам идентичные соответствующим клеткам крови, а также полибласты, зернистые шары, клетки арахноидэндотелия и новообразований (рис. 63).

Рис. 63. Клетки нормального ликвора. Вид в камере: 1 - микрофаг, 2 - макрофаг перстневидный, 3 - моноцит, 4 - зернистые шары, 5 - нейтрофилы, 6 - лимфоциты, 7 - плазмоциты, 8 - эритроциты, 9 - клетки эпендимы. В окрашенном препарате: 1 - макрофаг, 2 - полибласт, 3 - лимфоидный полибласт, 4 - зернистый шар, 5 - нейтрофилы, 6 - лифоциты, 7 - плазмоциты, 8 - эритроциты, 9 - клетки эпендимы, 10 - эозинофилы.