Система антигенов HLA

J. Dausset (1958) открыл первый лейкоцитарный антиген человека. В дальнейшем были выявлены другие такие антигены, имеющиеся почти во всех содержащих ядро клетках человека. В 1968 г. все лейкоцитарные антигены объединили в систему, получившую наименование HLA. Стабильность генетического детерминирования, высокая степень полиморфизма, завершение формирования системы HLA в ранние сроки онтогенеза, независимость ее от других систем крови делают систему тканевых антигенов весьма перспективной для использования в судебно-медицинской практике. К настоящему времени система HLA включает 77 различных антигенов. Все антигены обозначают символом системы, за которым указывают название локуса и цифру, обозначающую порядковый номер антигена: HLA-AI, HLA-BW16. Антигены, открытые несколькими исследователями, но нуждающиеся в дальнейшем уточнении, обозначаются буквой W (Workshop – рабочие названия). В литературе можно также встретить синонимы антигенов HLA: антигены тканевой совместимости, или гистосовместимости, трансплантационные, тканевые.

Четыре тесно сцепленных локуса контролируют антигены HLA, они локализованы на хромосоме № 6. Три локуса А, В и С контролируют серологически определяемые антигены лейкоцитов и других тканей; четвертый локус D расположен проксимальнее от локуса В, контролируемые им антигены выявляются в смешанной культуре лимфоцитов (реакции клеточного иммунитета).

В многочисленных семейных исследованиях установлено, что ребенок наследует по одной хромосоме, несущей гены HLA каждого из родителей, т. е. по одному гаплотипу – материнскому и отцовскому. Например, у родителей с гаплотипами:

Отец Al, В8 Мать АЗ, В7 А2, В12    А9, В5

могут быть дети со следующими сочетаниями гаплотипов системы HLA:

и т. д. (остальные комбинации происходят за счет повторений).

Таким образом, один человек обладает максимум четырьмя генами, при наличии гомозиготности цо одному или двум HLA-генам генотип соответственно состоит из трех или минимум двух HLA-антигенов. На основании сочетания антигенов HLA без учета их расположения на хромосоме можно установить фенотип HLA при обследовании неродственных лиц.

Характерной особенностью системы HLA является высокая степень полиморфности и разнообразия входящих в нее отдельных антигенов. Для локуса А известно 20, для локуса В-33, для локуса С-6 и. локусов D и DR – 18 антигенов. Разнообразные комбинации между антигенами, контролируемыми различными локусами, обусловливают огромное число теоретически возможных и действительно обнаруженных гаплотипов. Так, J. Dausset (1973) теоретически рассчитал более 35 000 возможных генотипов HLA, учитывая 14 аллелей локуса А и 19 аллелей локуса В. Если учесть число комбинаций, исходя из известных к настоящему времени специфичностей HLA, то каждая антигенная формула практически приблизится к индивидуальной. Именно это свойство особенно ценно для судебно-медицинской практики при проведении экспертиз спорного происхождения детей.

Система HLA является наиболее сложной иммуногенетической системой человека. Примером могут служить перекрестные реакции, происхождение которых можно объяснить биохимическим сходством антигенов и гетерогенностью антител, вырабатываемых против определенных антигенов. Впервые такие реакции были выявлены в отношении антигенов А2 и А28. Затем обнаружили перекрестные реакции между другими антигенами: А1, АЗ и All; B5, BW35 и В15; В27 и В40. Перекрестные реакции затрудняют получение моноспецифических сывороток, осложняют учет результатов при определении фенотипов, вследствие чего это явление должно быть всегда иод контролем и о нем необходимо хорошо знать. HLA- локусы тесно связаны между собой. Одним из доказательств такого сцепления являются обнаруженные между ними рекомбинации, которые у женщин встречаются чаще, чем у мужчин. Предполагают также, что локус системы HLA сцеплен с локусом, контролирующим иммунный ответ. К настоящему времени наиболее убедительным доказательством в пользу сцепления генов HLA с генами 1г являются данные, полученные D. Marsh и соавторами (1973). Авторы обнаружили связь между антигенами В7, В40, В27, В17, BW22 и аллергическими заболеваниями, причем у больных наблюдалось повышенное образование антител. Отмечена также связь гепов системы HLA с системой фермента фосфоглюкомутазы – PGM3. Сцепление локусов системы HLA с полом, а также с локусами систем крови (АВ0, Rh, MNSs, К, Ik, Fy, Le, Hp, Tf, Gm, Gc, Lp, Ag, Xg, Ко) не отмечается, относительно сцепления с локусами системы Р – нет единого мнения.

Антигены HLA располагаются на клеточных мембранах в виде небольших линейных участков протяженностью 0,1–0,3 нм, обнаруживаются почти во всех клетках и тканях организма, но в разном количестве. Если принять содержание антигенов HLA в селезенке за 100%, то в других органах их количество составит: в легких 50%, в печени 40%, тонком кишечнике 30%, почках 25%, сердце и желудке 10%, аорте и мозге 5%. HLA-антигены обнаружены в эндотелии сосудов, коже, сперматозоидах, фибробластах и др. Предполагают, что они есть и на эритроцитах. Некоторые HLA-антигены в растворимой форме обнаружены в семенной жидкости и сыворотке крови человека.

Тканевые антигены формируются во внутриутробном периоде. Они обладают значительной устойчивостью к воздействию внешней среды. Так, HLA-антигены сохранились в мышцах мумий более двухтысячелетней давности захоронения. Этот факт свидетельствует о возможности определения HLA-антигенов в высушенных тканях (тем более в пятнах крови).

В последние годы большое внимание уделяют изучению структуры HLA-антигенов. Известно, что они входят в сложный комплекс гликопротеидов и липидов клеточных мембран, представляющий собой иммуноглобулины, молекула которых состоит из двух полипептидных цепей. Одна из цепей идентична 32-макроглобулину, с молекулярной массой 41000 дальтон, вероятно, она свойственна всем HLA-антигенам. Другой компонент полипептидной цепи с молекулярной массой около 31000 дальтон специфичен для каждого HLA-антигена.

Типирование по системе HLA невозможно без соответствующих сывороток, источником которых пока еще остается кровь человека. Принципы получения сывороток анти-HLA разработал J. Dausset (1958) при изучении свойств антилейкоцитарных антител. Сыворотки анти-HLA получают из крови людей, перенесших многократные переливания крови, трансплантацию, а также от добровольцев после соответствующей иммунизации (введение различных доз лейкоцитов или трансплантация кожных лоскутов). К настоящему времени наиболее распространено получение таких сывороток из крови женщин, много раз перенесших беременность.

Процесс приготовления сывороток сложный, трудоемкий, требует дорогостоящей аппаратуры и оборудования. У рожениц (по добровольному согласию женщины и показанию врача) берут около 10 мл крови и смешивают ее с лимфоцитами примерно 30 постоянных доноров, по возможности с полным набором HLA-антигенов. При положительном результате реакции забор крови У соответствующих рожениц повторяют, но уже в количестве более 100 мл. Из крови получают сыворотку, которую замораживают и сохраняют при –40 °С. После этого сыворотки исследуют с лимфоцитами 100–120 постоянных доноров с заранее известными антигенами. Результаты обрабатывают на ЭВМ по специальной программе, сыворотки группируют по специфичности. В дальнейшем эти сыворотки проверяют в других лабораториях, занимающихся исследованием HLA-антигенов, после чего сыворотки можно использовать для типизации. Определение HLA без учета расположения генов на хромосоме называется тканевым типированием. Установленный фенотип изображают символом локуса А-системы, после него справа указывают определенные антигены, разделенные запятой (например. HLA-A1, HLA-B8,15). Сначала перечисляют антигены локуса А, затем В. Антигены локуса А и В разделяют точкой с запятой. Генотип HLA определяют при обследовании семей и записывают его как гаплотип (например, HLA-A1, В8/А2, В12). В основе определения HLA-антигенов лежит серологическая (реакция происходящая между антигеном, в качестве которого могут быть лейкоциты лимфоциты или тромбоциты, и антителом – сывороткой анти-HLA.
Существуют три основные методики типирования: реакция; дейкоагглютинации, лимфоцитотоксический тест и реакция связывания комплемента.

Реакция дейкоагглютинации основана на свойстве лейкоцитов агглютинироваться при воздействии соответствующих сывороток анти-HLA. Исследуемую кровь смешивают с раствором МагЭДТА, затем эритроциты осаждают с помощью высокомолекулярных соединений (плазмогеля, 10% раствора желатина и др.); 2/3 надосадочной жидкости, в которой содержатся лейкоциты, тромбоциты с примесью эритроцитов, отсасывают. Затем при фракционном центрифугировании получают осадок лейкоцитов и тромбоцитов. После первого центрифугирования в осадке содержатся лейкоциты с примесью эритроцитов, надосадочной жидкости, тромбоциты. Освобождаясь от примеси эритроцитов, получают лейкоциты, затем доводят количество лейкоцитов до 10 000 в 1 мкл, смешивают их с соответствующими сыворотками анти-HLA, выдерживают при 37° С в течение 90–120 мин, добавляют 6% уксусную кислоту, опять смешивают и по степени агглютинации лейкоцитов учитывают результаты. Наибольшее распространение получила микромодификация реакции.

Сущность лимфотоксической реакции заключается в том, что под воздействием сыворотки анти-HLA «гибнут» лимфоциты, содержащие антигенные детерминанты. Используюг наиболее чистую взвесь лимфоцитов, полученных из гепаринизированной или дефибринированной крови. Из исследуемой крови осаждают эритроциты (см. выше). После осаждения эритроцитов и получения лейкоцитарной взвеси отделяют лимфоциты от гранулоцитов фильтрацией через слой нейлоновой ваты, полиакриль- ное волокно, стеклянную вату и др. Лимфоцитарную взвесь можно получить с помощью карбонильного железа [Dausset J., 1968] или фиколизопакового градиента. Получают взвесь при центрифугировании в определенных режимах и гемолизе оставшихся эритроцитов. Выделенные лимфоциты под действием соответствующих сывороток анти-HLA в присутствии комплемента (кролика или морской свинки) «гибнут», окрашиваются красителем (трепановым синим или водорастворимым эозином, который проникает через поврежденную мембрану клеток) и хорошо видны под микроскопом. По количеству «убитых» лимфоцитов оценивают реакцию: до 25% окрашенных клеток – один плюс, 25%– 50% – два плюса, до 75% – три плюса, более 75% – четыре плюса.

В настоящее время наиболее распространена микролимфотоксическая реакция P. Terasaki в модификации J. Dausset. Для этого 15 мл крови помещают в 100 миллиметровую колбу Эрленмейера, в которой находится не менее 15 стеклянных бусинок, колбу вращают в течение 10 мин. Затем к 10 мл дефибринированной крови добавляют 5 мл 10% раствора желатина, подогретого до 37 °С, и тщательно перемешивают, пробирку помещают под углом 45° в термостат (37 °С) на 20 мин, а затем вертикально на 10 мин, после чего отсасывают 2/з надосадочной жидкости. Полученную надосадочную жидкость фильтруют через колонку с нейлоновой ватой. Фильтр центрифугируют при 225 g в течение 10 мин, надосадочную жидкость сливают, а к осадку добавляют 1 мл раствора Хенкса затем центрифугируют при 108 g в течение 8 мин. Надосадочную жидкость сливают, к осадку добавляют 5 капель раствора Хенкса и подсчитываются лимфоциты – до 1500 в 1 мкл. В под, готовленную лимфоцитную взвесь закапывают по 2 мкл сыворотки анти-HLA и помещают (в планшетах Терасаки) в термостат (37° С) яа 30 мин. Затем в каждую лунку добавляют по 5 мкл комплемента, планшеты вновь помещают в термостат на 60 миц. После этого планшеты встряхивают, добавляют 1 мкл раствора 0,2% трипанового синего, смешанного с 4,25% раствором NaCl в соотношении 4:1, планшет опять помещают в термостат на 15 мин, затем оставляют на 30 мин при комнатной температуре.

Реакция связывания комплемента на тромбоцитах впервые предложена J. Shulman (1962). При взаимодействии тромбоцитов и соответствующих сывороток (при наличии HLA- антигенов) фиксируется комплемент, вследствие чего уменьшается гемолиз бараньих эритроцитов, сенсибилизированных гемолитической сывороткой. По степени уменьшения гемолиза определяют наличие того или иного HLA-антигена. Реакция является самой сложной, на ее проведение требуется очень много времени.

По данным литературы, HLA-антигены с различной частотой распространены практически во всех популяциях. Для европеоидной популяции характерна высокая частота генов, детерминирующих антигены HLA Al, А2, АЗ, AW24, А10, В12, В7, B8 и BW35. Наиболее часто встречаются гаплотипы А2, В12; Al, В8; АЗ, B17; АЗ, BW35 и др. Для представителей монголоидной популяции (японской, китайской, сибирской) типична низкая частота антигенов HLA Al, А2, АЗ, высокая частота HLA А9, All, BW35, B40; часто встречаемые гаплотипы, свойственные этой популяции; HLA А9, B5; А9 и А2, B40. Африканская популяция характеризуется высокой частотой генов, детерминирующих антигены HLA AW 30, В17, В40, и низкой частотой – Al, All. С наиболее высокой частотой среди представителей этой популяции встречаются антигенные сочетания AW 23, B17; АЗ, B40; AW 30, В12 и др. Таким образом, африканской и монголоидной популяциям присуща низкая частота гена, детерминирующего антиген А1, в европеоидной популяции этот антиген, наоборот, может быть роковым маркером. Следовательно, система HLA может стать весьма перспективной при проведении экспертиз спорного происхождения детей.

В зарубежной литературе имеются указания на возможность использования системы HLA в таких экспертизах. Полученные данные свидетельствуют о том, что в экспертизах спорного отцовства си
стема HLA действительно является наиболее эффективной из всех известных в настоящее время эритроцитарных, сывороточных и ферментных систем крови. Так, использование в экспертизах спорного отцовства систем АВО, MNSs, Р, Kk, Rh (С, cCw, D, е, К (а, Ь), Le (a, b), xg (а), ЕР, РЕМ, АК, ADA, Нр, Gc, Gm, (а, х), Inv(l) и Se позволяет исключить ложно указанное отцовство в 94%, а по одной лишь системе HLA с набором сывороток анти-HLA к 26 антигенам – в 90%, применение всех известных систем крови вместе – в 99,4% случаев. L. Slepicka и A. Bartova (1973) на основании таблиц Хуммеля создали математическую модель, позволяющую исключить ложно указанное отцовство в 98,5% случаев.
Анализируя генетическое обоснование правил наследования системы HLA, W. R. Mayr (1972) и W. R. Mayr и соавт. (1974) разработали основные положения, которыми следует руководствоваться при исключении отцовства по системе HLA.

1. При наличии у ребенка хотя бы одного HLA-антигена, отсутствующего как у матери, так и у предполагаемого отца, вероятность исключения составляет около 80 %.
2. Если ребенок не обладает ни одним из признаков локуса, которые имеет отец, то вероятность исключения будет около 10%.
3. Когда ребенок t обладает гаплотипом, отсутствующим у предполагаемого отца, процент исключения невысок. Такая ситуация является наиболее сложной.

W. R. Mayr и соавт. (1974) приводят методику расчета вероятности отцовства по системе HLA, основанную, как и при использовании других систем крови, на применении математического метода Эссен-Мюллера и таблицы Хуммеля (1971, 1974). Расчеты эти чрезвычайно сложны, требуют обработки материала в крупных вычислительных центрах и нуждаются в дальнейшем совершенствовании в связи с накоплением новых данных о системе HLA. Авторы предложили теоретическую модель для расчета вероятности исключения отцовства по двум локусам системы HLA при помощи ЭВМ. Модель включает различных вариантов. Однако применение этих расчетов ограничивается небольшим числом наблюдений.

Все исследователи отмечают, что давать заключения в экспертизах спорного отцовства нужно очень осторожно, особенно при исключениях. В сомнительных случаях рекомендуется прибегать к повторным исследованиям В отечественной литературе в последние годы появились отдельные работы, посвященные использованию системы HLA в экспертизах спорного отцовства. В 1978 г. была защищена первая диссертационная работа, посвященная этой проблеме (Г. Ф. Кривда «Популяционно-генетическое изучение системы лейкоцитарных антигенов человека (HLA) среди населения юга Украины и применение ее в практике судебной медицины»). Г. Ф. Кривда впервые в нашей стране применил систему HLA в 65 экспертизах опорного отцовства (параллельно с использованием систем АВ0, MN, Р, Rh, Нр), В 8 случаях удалось исключить ложно указанное отцовство, причем в 4 случаях – только по системе HLA. Анализ экспертиз подтвердил наследование HLA-антигенов по гаплотипам. Каких-либо отклонений от правил наследования этих антигенов в паузах мать – ребенок обнаружено не было. Авторы использовали основные критерии исключения ложно указанного отцовства:

• обязательность наследования ребенком HLA-антигенов от его родителей;
• появление в фенотипе ребенка HLA-антигенов, не имеющихся у родителей, служит основанием для исключения, при этом исключение отцовства проводилось как по одному антигену локуса, так и по обоим антигенам;
• обнаружение у ребенка гаплотипа, отсутствующего у предполагаемого отца. Для такого варианта исключения необходимы информация о частоте встречаемости гаплотипов HLA в популяции, а также обследование близких родственников предполагаемого отца. Применение расширенного семейного анализа по гаплотипам позволяет повышать процент исключения ложно указанного отца. Поэтому в отдельных случаях, когда отцовство не исключается но системе HLA, необходимо информировать судебные органы о целесобразности исследования крови близких родственников предполагаемого отца для выяснения его гаплотипа и окончательного вывода экспертизы.

Итак, система HLA вполне пригодна для экспертиз спорного отцовства и по сравнению с системами АВ0, MN Р, Rh и Нр значительно повышает процент исключения ложно указанного отцовства.

Как уже отмечалось, ребенок наследует HLA-антигены от родителей по гаплотипам. Поэтому в случае обнаружения у ребенка гаплотипа, отсутствующего у предполагаемого отца, отцовство также исключается. Такая ситуация при проведении экспертиз спорного отцовства наиболее трудна, и не всегда удается исключить отцовство на основании гаплотипов HLA. Объясняется это тем, что отцовство исключается после точного определения гаплотипа предполагаемого отца, иногда и матери. Это возможно лишь при обследовании их родителей, а при наличии рекомбинации – при расширенном обследовании близких родственников, включая братьев и сестер. Например, если у матери выявлены HLA-антигены А2, W23; В5, 12; у отца – All; В7, 12 и ребенка – А2; В5, 12, то однозначный вывод по результатам исследования системы HLA сделать нельзя. Так, если допустить, что ребенок унаследовал от матери HLA-антигены А2, В5, а от отца В12, то отцовство не исключается. Если же предположить, что ребенок мог унаследовать антигены А2, В12 от матери, тогда отцовство исключается. Окончательный вывод возможен только после выявления гаплотипов ответчика или матери. В подобных случаях установление гаплотипа может внести определенную ясность и окончательно решить этот вопрос. В связи с этим Г. Ф. Кривда рекомендует устанавливать гаплотип предполагаемого отца во всех случаях, когда отцовство не исключается по системе HLA, по следующей схеме.

На первом этапе определяют фенотип матери предполагаемого отца (если матери нет – то отца). При обнаружении общих HLA-антигенов путем исключения устанавливают гаплотип матери предполагаемого отца и ребенка; если отцовство не исключается, гаплотипы должны совпадать. В таких случаях в заключении следует писать: «отцовство возможно с большой вероятностью». Это важно, особенно когда у обследуемых лиц оказываются редкие гаплотипы HLA и проведен популяционно-генетический анализ. На втором этапе, когда антигены бабушки предполагаемого отца и ребенка не совпадают, что возможно при рекомбинации, или если отцовство исключается, обязательно типируются антигены дедушки и хотя бы двоих его детей. В результате такого исследования выясняют, была ли рекомбинация. Если она была, то отцовство не исключается, если не была, отцовство исключается.