Система эритроцитарной аденозиндезаминазы
Аденозиндезаминаза (АДА) катализирует реакцию дезаминирования аденозина, при которой аденозин превращается в инозин. Активность АДА проявляется в большинстве тканей человеческого организма и эритроцитах.
N. Spencer и соавт. ()1968) с помощью электрофореза в крахмальном геле с последующим выявлением активности АДА впервые выявили три вида изоферментных спектров АДА в гемолизатах эритроцитов крови различных людей. Авторы предположили, что наблюдаемый ими изоферментный полиморфизм является генетически обусловленным.
Для электрофореза N. Spencer и соавт. использовали две непрерывные буферные системы, в которых изоферменты разделялись приблизительно одинаково: фосфатную с pH 6,5 (0,01 М фосфатный гелевый буфер и 0,1 М фосфатный электродный буфер) и цитратную с pH 5,9 (0,005 М цитратный гелевый буфер и 0,1 М цитратный электродный буфер). Использовали 12% крахмальный гель, электрофорез проводили 16–17 ч при 4 °С и напряжении 3–3,5 В/см. G. Radam и Н. Strauch (1971) для выявления изофермент- ного спектра АДА рекомендуют несколько другие условия электрофореза: электродный буфер – 0,1 М КН2Р04, pH 6,5; гелевый буфер – 0,001 М КН2Р04, pH 6,5. Электрофорез проводят 4 ч при 4 °С и напряжении 10 В/см.Принцип выявления энзиматической активности АДА основан на следующем. В результате воздействия АДА на аденозин, являющийся для нее субстратом, последний дезаминируется и переходит в инозин, который в присутствии нуклеозидфосфорилазы и арсената (или фосфата) переходит в гипоксантин. Гипоксантин в свою очередь в присутствии ксантиноксидазы окисляется. Окисленный гипоксантин под действием МТТ и ФМС дает цветовую химическую реакцию, в результате которой в осадок выпадают нерастворимые соли формазана фиолетового цвета.
Ферментативную активность АДА чаще всего выявляют с помощью агаровой аппликации. На водяной бане предварительно растворяют 100 мг агара в 100 мл 0,025 М фосфатного буфера pH 7,5 или в 100 мл 0,06 М или 0,1 М трис-буфера pH 8. После охлаждения раствора до 40–45 °С в него добавляют 40 мг аденозила, 10 мг МТТ и ФМС, 40 мкл суспензии ксантиноксидазы (0,16 ME), 40 мкл суспензии нуклеозидфосфорилазы (1,6 ME) и 150 мг арсената натрия. После растворения реагентов смесь выливают на поверхность крахмального геля и инкубируют 1–2 ч при 37 °С до появления фиолетовых зон формазана в местах активности АДА.
Для выявления изоферментов эритроцитарной АДА предлагают использовать и другие разделительные методы: электрофорез на ацетатцеллюлозных пленках или мембранах, горизонтальный электрофорез в ПААГ, горизонтальный высоковольтный электрофорез в тонком слое крахмального геля.
В результате семейных обследований и обследований многочисленных пар мать – ребенок A. Spencer и соавт. (1968) смогли убедиться в правильности созданной ими формально-генетической модели наследования групп эритроцитарной АДА. Согласно этой гипотезе, в соответствующем генном локусе на аутосомальной хромосоме действует пара аллельных генов, обозначенных аллелями АДА1 и АДА2, которые, являясь по отношению друг к другу кодоминантными, обусловливают появление трех фенотипов этой ферментной системы: двух генотипически гомозиготных по соответствующим аллелям (АДА-1 и АДА-2) и одного генотипически гетерозиготного (АДА-2-1). Семейные обследования, а также исследования не связанных родством лиц, проведенные за последние годы во многих странах, свидетельствуют о значительном превалировании частоты встречаемости аллеля АДА1 (90-95/о) над частотой встречаемости аллеля АДА2 (5–10%), вследствие чего-значительно чаще встречается гомозиготный фенотип АДА-1, реже гетерозиготный фенотип АДА-2-1 и еще реже – гомозиготный фенотип АДА-2.
Уже на следующий год после открытия генетически обусловленного полиморфизма эритроцитарной АДА в генном локусе этой системы были обнаружены и другие, по-видимому, редкие аллели АДА3, и АДА5. Во всех случаях необычные фенотипы, обусловленные действием этих атипичных аллелей, генотипически характеризовались гетерозиготной формой по аллелю АДА3, АДА4 или АДА5 и наиболее распространенному аллелю АДА\ т. е. соответственно фенотипы АДА-3-1, АДА-4-1 и АДА-5-1. Фенотип АДА-3-1 очень похож на обычный гетерозиготный фенотип АДА-2-1: он характеризуется четырьмя изоферментами, обладающими такой же электрофоретической подвижностью, как и четыре изоформы при фенотипе АДА-2-1. Однако в отличие от фенотипа АДА-2-1 два медленно мигрирующих к аноду изофермента при фенотипе АДА-3-1 выражены значительно слабее. Гетерозиготный фенотип АДА-4-4 отличается от всех других известных фенотипов этой системы, поскольку его изофер- ментный спектр характеризуется 4 изоферментами, присущими фенотипу АДА-3-1, и еще одним пятым изоферментом, наиболее медленно мигрирующим к аноду. Гетерозиготный фенотип АДА-5-1 характеризуется четырьмя групповыми изоферментами, скорость миграции которых к аноду превышает таковую во всех известных ранее фенотипах этой системы. На рис. 18 изображены групповые изоферментные спектры трех основных и трех атипичных фенотипов системы АДА.
Рис. 18. Схематическое изображение трех основных (1, 2, 2-1) и трех атипичных фенотипов (3-1, 4-1, 5-1) аденозиндеаминазы.
В дальнейшем G. Radam и соавт. [цит. по Prokop D. и Gohler W., 1976] выявили еще один атипичный аллель, названный ими аллелем АДА6. Интересно, что все до сих пор описанные атипичные аллели (АДА3 – АДА6) встречались в гетерозиготной форме с аллелем АДА\ за исключением одного случая обнаружения фенотипа АДА-5-2, генотипа АДА5/АДА2. Судебно-медицинским экспертам, использующим генетически обусловленный полиморфизм ферментной системы АДА, необходимо учитывать и возможность наследственной передачи «немого» аллеля АДА0, существование которого в генном локусе этой системы доказано в многочисленных семейных обследованиях.
Необходимо отметить, что почти для всех генетически детерминированых систем крови человека (точнее для генных локусов, контролирующих полиморфизм этих систем), используемых для экспертного решения вопроса о возможности или невозможности рождения того или иного ребенка от определенной родительской пары, доказано существование, а следовательно, и возможность наследственной передачи «немых», или «скрытых», аллелей. Большинство таких аллелей, по-видимому, встречается чрезвычайно редко. Однако, поскольку целенаправленных исследований, посвященных изучению частоты их встречаемости в той или иной системе крови человека, не проводилось, не исключено, что в некоторых системах частота «немых» аллелей не такая уж низкая. Поэтому неучитывание возможности наследственной передачи таких аллелей, особенно (что чаще всего и бывает) при гетерозиготной форме с обычным структуральным геном, таит в себе большую опасность ошибочного трактования мнимой гомозиготности вместо истинной гетерозиготности по структуральному и «немому» аллелю. Все это в полной мере относится и к системе эритроцитарной АДА.
Во всех случаях противоположной гомозиготности ребенка и одного из его предполагаемых родителей, исключающей возможность рождения ребенка от данной родительской пары, судебно-медицинский эксперт, использующий в своих исследованиях генетически детерминированный полиморфизм системы АДА, обязан в первую очередь обращать внимание на выраженность ее групповых изоферментов в гемолизатах эритроцитов ребенка и исключенного» родителя. Снижение выраженности изоформ АДА при противоположно гомозиготных фенотипах АДА-1 и АДА-2 по сравнению с таковой в контрольных образцах или с выраженностью при гетерозиготном генотипе АДА-2-1 свидетельствует, очевидно, о наследственной передаче от данного родителя ребенку не структурального аллеля АДА0, который обусловливает дефицит ферментативной активности. Для доказательства: такой наследственной передачи атипичного «немого» аллеля эксперт обязан также провести, если это возможно, расширенное исследование изоферментов АДА у ближайших родственников предполагаемого родителя. Кроме того, в таких случаях желательно провести и количественный фотоколориметрический учет ферментативной активности в гемолизатах эритроцитов ребенка и его предполагаемого родителя. Доказательство генотипической гетерозиготности фенотипов АДА по аллелю АДА0 и соответствующим структуральным аллелям АДА1 и АДА2 служит веским основанием для утверждения того, что данное лицо является действительным родителем ребенка.
Преобладание частоты встречаемости аллеля АДА1 над таковой аллеля АДА2, которое наблюдается во всех основных расах людей, снижает полиморфность этой системы. Это отражается и на процентной вероятности исключения отцовства по данной системе. Например, средняя вероятность исключения отцовства по системе АДА среди европеоидных, негроидных и монголоидных популяций, по данным D. Hopkinson и соавт. (1968), составляет соответственно 4,82; 2,83 и 2,91%. По данным О. Ргокор и W. Gohler (1976), эта величина для населения Европы несколько выше и колеблется в пределах 5–7%.
Многие судебно-медицинские эксперты считают, что редкие атипичные фенотипы этой системы, обусловленные действием атипичных аллелей АДАг, АДА4, АДА$, АДА6 и АДА0 и выявляемые у ребенка и его предполагаемого отца, можно использовать для подтверждения отцовства. Однако во всех таких случаях целесообразно провести параллельное электрофоретическое исследование в гелях крахмала и полиакриламида, поскольку эти методы, обладая максимальной разделительной способностью, позволят подтвердить наличие у ребенка и его предполагаемого отца необычных групповых изоферментов.
