Система эритроцитарной эстеразы D
В эритроцитах крови человека содержится большое число карбоксигидролаз (эстераз) различных классов и подклассов, появление и активность которых контролируется структуральными генами не менее 9 различных генных локусов. Большинство из них не обладает генетически обусловленной полиморфностью, за исключением некоторых эритроцитарных карбоангидраз.
D. Hopkinson и соавт. (1973) при изучении эстеразной активности в гемолизатах эритроцитов крови человека выявили новую, специфичную только для данных субстратов эстеразу, ее назвали эстеразой D (ЭсЕ)). Оптимум pH фермента 5,0–5,5, молекулярная масса около 60000 дальтон. Используя метод электрофореза в крахмальном геле с последующим выявлением ферментативной активности 3cD, D. Hopkinson и соавт. (1973) обнаружили три разных изоферментных спектра 9cD и высказали предположение о генетической обусловленности полимор, физма ЭсБ. Семейные обследования пар мать – ребенок, проведенные этими исследователями, свидетельствовали о простом кодоминантном аутосомальном порядке наследования трех групп фермента. Их полиморфизм обусловлен действием в соответствующем генном локусе этой системы пары аллельных генов, обозначенных аллелями dcD1 и 9cD2. Эти аллели ответственны за появление трех групп эритроцитарной ЭсБ: двух генотипически гомозиготных по соответствующему аллелю (9cDA и 9cD-2) и одной генотипически гетерозиготной по этим аллелям (3cD-2-il). Электрофоретически изоферментный спектр фенотипа 3cD-l характеризуется двумя интенсивными зонами, медленно мигрирующими к аноду, фенотип 8cD-2 – также двумя зонами, но менее интенсивными, быстро мигрирующими к аноду, фенотип ЭсБ-2-1 – четырьмя изоферментами, скорость миграции которых совпадает с электрофоретической подвижностью четырех изоферментов, наблюдаемых в гомозиготных фенотипах ЭсВ-1 и 3cD-2 (рис. 20).
Рис. 20. Схематическое изображение трех основных фенотипов эстеразы D
Для электрофоретического разделения групповых изоферментов эритроцитарной ЭсБ предложены различные методы электрофореза в гелях крахмала, агарозы, на адетатцеллюлозных мембранах и в целлогеле.
Метод электрофореза в крахмальном геле по D. Hopkinson и соавт. (1963). Используют прерывистую трис- цитратно-боратно-гидроксидлитиевую буферную систему pH 6,8. Гелевый буфер: 0,1 М раствор триса, доведенный до pH 6,8 лимонной кислотой. Электродный буфер: раствор 0,2 М Н3ВО3 и 0,02 М гидроксида лития, pH 6,8. Электрофорез проводят 16–17 я при 4–6 °С при напряжении 5–6 В/см.
Метод электрофореза в крахмальном геле по Stohlmacher R. и Haferland W. (1964). Применяют непрерывную фосфатную буферную систему pH 7,4. Основной буферный раствор: 500 мл 0,1 М К2НРО4 + 150 мл 0,1 М КН2РО4, pH 7,4. Электродный буфер: 200 мл основного буферного раствора + 600 мл дистиллированной воды, pH 7,4. Гелевый буфер: 3 мл основного буферного-раствора+ 247 мл дистиллированной воды, pH 7,4. Электрофорез проводят 7 /2 ч при напряжении 14 В/см и циркуляционном охлаждении.
Метод электрофореза в целлогеле по A. Struijk (1976). Используют прерывистую систему, предложенную D. Hopkinson и соавт. (1963). Электрофорез проводят 2 ч при комнатной температуре и постоянном напряжении тока 200 В. Недостаток метода – быстрая диффузия изоферментных зон после их выявления в геле, поэтому требуется очень быстрый учет результатов.
Метод высоковольтного электрофореза в геле агарозы по В. Roster и соавт. (1975). Применяют непрерывную трис-цитратную буферную систему pH 7,2. Электродный буфер: 0,2 М раствор триса, доведенный до pH 7,2 лимонной кислотой. Гелевый буфер: электродный, разведенный дистиллированной водой 1:4 Электрофорез проводят 2 ч при напряжении 14 В и циркуляционном охлаждении. По мнению многих авторов, использовавших различные разделяющие среды, самые эффективные результаты получались при использовании электрофореза в геле агарозы.
Метод электрофореза в тонком слое крахмального геля по В. Parkin и Е. Adams (1975). Готовят блок 12% крахмального геля размером 20 см Х15 см X 1 мм. Используют как непрерывную фосфатную буферную систему с pH 7,4 по A. Stohlmacher и W. Haferland, так и прерывистую трис-цитратно-боратно- гидроксидлитиевую систему с pH 6,8 по D. Hopkinson и соавт. Высоковольтный электрофорез проводят 3 ч при напряжении 12–14 В/см и циркуляционном охлаждении.
Ферментативную активность электрофоретически разделенных групповых изоформ эритроцитарной 9cD выявляли по методике, лредложенной D. Hopkinson и соавт. (1973). Специфичным для 3cD субстратом является 4-метил-умбеллиферрилацетат (или бутират).
Фермент, расщепляя этот субстрат, освобождает люминесцирующий в ультрафиолетовых лучах умбеллиферрон.
На гель накладывают фильтровальную бумагу, смоченную следующим раствором: 2–3 мг субстрата растворяют в 1 мл ацетона и добавляют 10 мл 0,05 М ацетатного буфера pH 5,2. Аппликацию проводят 5–10 мин при комнатной температуре, после чего фильтровальную бумагу удаляют, поверхность геля промывают дистиллированной водой, а затем гель подвергают ультрафиолетовому облучению (А=360 нм) в темном помещении: зоны изоферментов люминесцируют.
Частота встречаемости аллелей ЭсП1 и 9cD2 среди европейского населения составляет в среднем соответственно 88 и 12 %.
К. Bender и R. Frank (1974) в одной немецкой семье впервые выявили новый необычный фенотип эритроцитарной 0cD, передающийся по наследству. Характер изо- ферментного спектра 9cD этого фенотипа, при котором, помимо изоферментов, свойственных обычному гомозиготному фенотипу 9cD-l, наблюдались необычные изоформы, свидетельствовал о его генотипической гетерозиготности по обычному аллелю 9cDl и атипичному, обозначенному аллелем 9cDz. Вскоре атипичный гетерозиготный фенотип 3cD-3-l обнаружили и другие исследователи.
К. Berg и соавт. (1976) описали еще один гетерозиготный фенотип и обозначили его 3cD-4-4. Это свидетельствовало о существовании в генном локусе системы 9cD еще одного редкого атипичного аллеля – 3cD4 Т. Suzuki и соавт. (1978) при исследовании полиморфизма ЭсБ среди 2367 не связанных родством японцев выявили редкие гетерозиготные варианты 3cD-3-2 в двух случаях и в одном случае еще один, появление которого связано, по-видимому, с действием еще одного атипичного аллеля в генном локусе системы 0cD.
Четкий аутосомально-кодоминантный порядок наследования групп эритроцитарной 3cD, прослеженный на обширном материале, позволяет использовать полиморфизм этой генетически детерминированной ферментной системы в судебно-медицинских экспертизах спорного происхождения детей. D. Dykes и Н. Polesky (1977) оценили информативность системы 3cD при использовании ее в экспертизах. Полиморфизм эритроцитарной 3cD авторы исследовали в 206 экспертизах спорного отцовства: из 39 исключений в 5 случаях мужчины, не являвшиеся фактическими отцами того или иного ребенка, были исключены только по генетическим маркерам этой системы. По данным О. Prokop и W. Gohler (1976), вероятность исключения отцовства по системе 3cD для европейского населения составляет приблизительно 9–10%. Учитывая гораздо более частую частоту встречаемости аллеля 9cD* среди монголоидных популяций, можно утверждать, что процентная вероятность исключения мужчин, ложно указанных в качестве отца, по системе ЭсЕ) в этой популяции будет значительно выше.
Хотя существование в генном локусе системы 3cD «немого» аллеля 0cD° еще не доказано, В. Brinkmann и К. Piischel (1978) полагают, что надо быть осторожным при исключении отцовства или материнства по противоположной гомозиготности этой системы. Авторы особо обращают внимание на тот факт, что из-за низкой субстратной специфичности фермента трудно дифференцировать уменьшение выраженности изоферментов ЭсБ при гетерозиготной форме по основному и «немому» аллелю от снижения выраженности изоферментов ЭсВ. Это связано с использованием того или иного субстрата. Кроме того, авторы справедливо отмечают, что, поскольку до настоящего времени не разработан формазановый гистохимический метод для обнаружения активности ЭсБ, генетически обусловленный полиморфизм фермента приходится выявлять с помощью люминесцентного метода, при котором интенсивность свечения может зависеть также и от технических факторов, длины волны ультрафиолетовых лучей и др. Еще не созданы методы точного колориметрического определения активности ЭсБ. Все это, конечно, не относится к случаям исключения отцовства, когда, например, мать ребенка и его предполагаемый отец имеют любой одинаково гомозиготный фенотип, а ребенок – гетерозиготный фенотип ЭсБ-2-1.
Н. Schmechta (1977) отмечал изменение и ослабление групповых изоферментных спектров ЭсБ при хранении проб крови. Из этого следует, что в экспертных исследованиях необходимо использовать только свежеприготовленные гемолизаты эритроцитов.
