Система эритроцитарной глиоксалазы I
Глиоксалаза I (ГлО) (K.4.4.1.5) катализирует расщепление S-лактоилглутатиона на метилглиоксаль и глутатион.
J. Kompf и соавт. (il975) при электрофорезе гемолизатов эритроцитов крови различных людей с последующим выявлением активности ГлО наблюдали три различных изоферментных спектра. Авторы предположили, что полиморфизм ГлО имеет генетическую природу. Результаты семейных обследований подтвердили правильность этого предположения. По предложенной авторами гипотезе наследования групп эритроцитарной ГлО, в едином аутосомальном генном локусе этой системы действует пара кодоминантных аллельных гена – ГлО1 и ГлО2. Эти аллели обусловливают появление трех фонотипов: двух генотипически гомозиготных но соответствующему алле- лю (фенотипы ГлО-l и ГлО-2) и одного генотипически гетерозиготного (фенотип ГлО-2-1).
P. Khan и В. Doppert (1976), подтвердив открытый J. Kompf и соавт. (1975) генетически обусловленный полиморфиз эритроцитарной ГлО, на основании электрофоретической картины групповых изоферментов при трех фенотипах (по одному изоферменту в гомозиготных фенотипах ГлО-l и ГлО-2 и трем изоферментам в гетерозиготном фенотипе ГлОн2ч1) предположили, а потом и доказали, что функциональная молекула фермента является димером. Интерес к этой ферментной системе в последнее время повысился потому, что была установлена локализация ее генного локуса на аутосомальной хромосоме № g. и доказано тесное сцепление генных локусов системы тканевой совместимости, или системы тканевых антигенов HLA. Далее было показано, что генный локус системы ГлО тесно сцеплен и с генным локусом ФГМ. Для разделения групповых изоферментов эритроцитарной ГлО предложено большое число электрофоретических методов. Остановимся лишь на наиболее распространенных.
Электрофорез в крахмальном геле по J. Kompf и соавт. (1975). Используют непрерывную трис-HCl гистидин-буферную систему, pH 7,8. Электродный буфер: 0,2 М трис-гистидиновый буфер, pH 7,8. Гелевый буфер: электродный, разведенный дистиллированной водой 1:10. Электрофорез проводят 14 ч при 2 °С и напряжении 7 В/см.
Электрофорез в крахмальном геле по P. Kiihnl ir соавт. (1977). Применяют непрерывную фосфатно-натриевую буферную систему, pH 6,7. Электродный буфер: 0,2 М фосфатно-натриевый буфер, pH 6,7. Гелевый буфер: 0,0075 М фосфатно-натриевый буфер, pH 6,7, Электрофорез проводят 3 ч при напряжении 10 В/см и циркуляционном охлаждении.
Электрофорез в крахмальном геле по A. Ghosh (1977). Используют непрерывную трис-боратно-цитратно-гидроксид-литиевую буферную систему, pH 7,2. В электродном буфере содержится 0,2 М электролитов, pH 7,2. Гелевый буфер: электродный, разведенный дистиллированной водой 1:10. Электрофорез проводят 18 ч при +10 °С и напряжении 4 В/см.
Электрофорез в ацетатцеллюлозном геле (целлогеле) по P. Khan и В. Doppert (1976). Электрофорез осуществляется на пластинах целлогеля размером 16 см X 17 см X 0,5 ммг Используют трис-барбитуровую буферную систему, pH 8,0. Буфер: 0,03 М триса, 0,03 М барбитуровой кислоты, 0,2 мл Р-меркаптоэтанола и 0,4 мл 1 М MgGU в 1 л дистиллированной воды. Гемолизаты эритроцитов в количестве 2 мкл наносят в катодную зону целлогеля, электрофорез проводят при постоянном напряжении тока 200 В в течение 3 ч при комнатной температуре (без охлаждения геля и электродных буферных сосудов).
Высоковольтный электрофорез в геле агарозы по W. Martin и A. Ott (1977). Используют непрерывную фосфатную буферную систему, pH 7,4. Электродный буфер: 0,2 М фосфатно-натриевого электролита. Гелевый буфер: тот же электролит в концентрации 0,02 М. Электрофорез проводят 2 ч при напряжении 15 В/см и циркуляционном охлаждении.
Активность групповых изоферментов ГлО выявляют по методу J. Kompf и соавт. (1975). На поверхность целлогеля (или геля агарозы на продольно разрезанную поверхность крахмального геля) накладывают фильтровальную бумагу, смоченную 0,2 М буфером, pH 6,8, содержащим 257 М метилгиоксаля и 16,3 мМ восстановленного глутатиона. Гель, покрытый фильтровальной бумагой, помещают в термостат при 37 °С на 30 мин, после чего бумагу удаляют и на поверхность геля наносят агаровую аппликацию [1% расплавленный агар, содержащий МТТ (1,2 мг на 1 мл) и следы дихлорфенолиндофенола, в 0,1 М трис-НС1-буфере, pH 8,5]. Гель снова помещают в термостат при 37 °C на 15–20 мин до появления бледных зон ферментативной активности на зеленовато-голубом фоне геля. P. Khan и В. Doppert (1976) рекомендуют несколько иной способ.
Готовят два раствора. Раствор № 1: 1,6 мл 0,1 М фосфатного буфера, pH 6,5, содержащего 100 мкл метилглиоксаля, 12 мг восстановленного глутатиона и 0,4 мл раствора МТТ (2 мг/мл). Раствор № 2: 1,8 мл 0,1 М трис-НС1-буфера, pH 7,8, и 0,2 мл раствора 2,6-дихлорфенолиндофенола (2 мг/мл). После электрофореза на гелевую поверхность заливают свежеприготовленный раствор № 1. Через несколько секунд гель слегка промокают фильтровальной бумагой и сразу же заливают раствором № 2. После 10–20-минутной инкубации во влажной камере при комнатной температуре производят учет результатов. Зоны ферментативной активности проявляются в виде пурпурных полос на зеленовато-голубом фоне геля.
Ферментная система эритроцитарной ГлО весьма информативна для экспертизы спорного отцовства благодаря высокой частоте встречаемости двух ее основных аллелей, обусловливающих генетически детерминированный полиморфизм системы. Частота встречаемости основных аллелей особенно велика в европеоидной популяции. Например, по данным P. Koziol и Т. Dobosz (1978), эта величина среди населения Польши составляет для аллелей ГлО1 и ГлО2 соответственно 44,27 и 55,73 %, что позволяет только по этой системе «исключить» ,18,46 % мужчин, ложно указанных в качестве отцов. Для подтверждения формально-генетической гипотезы о двуаллельном кодоминантном аутосомальном порядке наследования групп эритроцитарной ГлО авторы обследовали 372 пары мать – ребенок. Как и ожидалось, ни разу не была обнаружена противоположная гомозиготность по аллелям ГлО у ребенка и его матери.
С этой же целью P. Khan и В. Doppert (1976) обследовали 11 так называемых «критических» родительских пар, в которых оба родителя имели один и тот же или различный гомозиготный фенотип по системе ГлО. При этом все 47 детей, родившихся в этих семьях, имели единственно возможный для них гомо- или гетерозиготный фенотип: ГлО-1ХГлО-1 (1 родительская пара – все четверо детей имели фенотип ГлО-l), ГлО-2ХГлО-2 (6 пар –все 23 ребенка имели фенотип ГлО-2), ГлО-1Х, ХГлО-2 (4 пары – все 20 детей имели фенотип ГлО-2-u).
Многие исследователи указывают на полную онтогенетическую сформированность групп эритроцитарной Гло к моменту рождения ребенка. Это является чрезвычайно важным моментом для использования генетически обусловленного полиморфизма этой системы в экспертизах спорного отцовства при ранних сроках жизни оспариваемого ребенка.
Интересно, что до сих пор среди различных в популяционном отношении этнических групп еще ни разу не был выявлен необычный фенотип, являющийся генетическим продуктом какого-либо атипичного структурального аллеля в генном локусе системы ГлО. Такую мономорфность системы ГлО, без каких-либо атипичных структуральных аллелей в генном локусе, можно сравнить лишь с некоторыми изосерологическими эритроцитарными системами, поскольку в подавляющем большинстве сывороточных и во всех известных генетически детерминированных ферментных системах крови человека такие аллели в соответствующих генных локусах уже найдены.
Для судебных медиков, использующих полиморфизм системы эритроцитарной ГлО в экспертизах спорного отцовства, небезынтересна противоположная гомозиготность по этой системе между женщинами и их детьми в трех поколениях одной немецкой семьи [Rittner Ch., Weber W.r 1978]. Возможность перепутывания детей исключалась. Во всех случаях наблюдения противоположной гомозиготности между матерями и их детьми по системе ГлО выраженность изоферментного спектра при якобы гомозиготных фенотипах ГлО-1 и ГлО-2 была резко снижена. Это свидетельствовало о дефиците ферментативной активности и генотипической гетерозиготности по обычному структуральному и «скрытому», или «немому», аллелю ГлО°. «Немой» аллель в гетерозиготной форме обусловливает снижение активности фермента в эритроцитах почти на 50% по сравнению с нормой.
Возможность наследственной передачи аллеля ГлО°, маскирующая истинную гетерозиготность мнимой гомозиготностыо, нужно учитывать при проведении экспертиз спорного происхождения детей. Во всех случаях исключения отцовства или материнства по противоположной гомозиготности системы ГлО (так же как и по противоположной гомозиготности других ферментных генетически детерминированных систем крови человека) судебно-медицинский эксперт обязан выявить активность противоположно гомозиготных групп фермента (либо по интенсивности окрашивания изоферментов, либо путем непосредственного количественного колориметрического измерения активности). При снижении активности фермента в первую очередь надо думать о наследственной передаче аллеля ГлО°. Это можно доказать с помощью расширенного исследования групп ГлО в эритроцитах крови ближайших родственников ответчика.
