Система эритроцитарной кислой фосфатазы
В последние годы была доказана молекулярная гетерогенность некоторых белков и большинства ферментов организма человека. Это стало возможным благодаря совершенствованию различных методов электрофоретического анализа в сочетании с выявлением специфической активности того или иного фермента. Структуру электрофоретически разделенного фермента в настоящее время можно представить его ферментограммой, изоферментным спектром. Изоферменты – это множественные молекулярные формы фермента, которые, обладая одинаковой, строго определенной биохимической направленностью, различаются по физико-химическим свойствам (электрофоретической подвижности, молекулярной массе, электрическому заряду и др.).
Большим достижением современной энзимологии и биохимической генетики явилось открытие генетической обусловленности ферментного полиморфизма, проявляющегося во многих ферментных системах крови, выделениях, клетках и тканях живого организма. Благодаря этому возникло новое понятие о ферментных системах крови (эритроцитарных, сывороточных и лейкоцитарных), тканей и выделений человека, которые привлекают внимание специалистов различных областей биологии и медицины и естественно, судебных медиков. Открыто большое число генетически детерминированных ферментных систем крови человека, некоторые из которых находят свое практическое применение в судебно-медицинских экспертизах спорного отцовства. Остановимся лишь на тех системах, которые по частоте встречаемости аллелей, обусловливающих полиморфизм, наиболее информативны для экспертизы спорного происхождения детей.
Система кислой фосфатазы (КФ 3.1.3.2) эритроцитов (КФЭ) была открыта D. Hopkinson и соавт. (1963) с помощью электрофореза в крахмальном геле.
Гемолизаты эритроцитов крови от различных лиц готовили из отмытых эритроцитов путем многократного замораживания и оттаивания. Строма разрушенных эритроцитов осаждалась центрифугированием, исследовали прозрачный лаковый супернатант. Для электрофореза использовали прерывистую трис-янтарно-цитратную буферную систему с pH 6,0. Гелевый буфер: 0,0026 М янтарной кислоты и 0,0046 М трис-буфера в 1 л дистиллированной воды; электродный буфер: 0,41 М лимонной кислоты и 1,18 М NaOH в 1 л дистиллированной воды. Электрофорез проводили при 4°С в течение 16–17 ч, напряжение 6–7 В/см.
Для выявления зон ферментативной активности использовали инкубационную смесь: 143 мг дифосфата фенолфталеина (трех- латриевая соль) растворяли в 50 мл 0,05 М цитратного буфера (10,51 г лимонной кислоты, 6,38 г/л NaOH) и доводили раствор до pH 6,0 041 М лимонной кислоты. После электрофореза крахмальный гель продольно разрезали на две части и нижнюю половину блока инкубировали 2–3 ч при 37 °С в растворе субстрата. Затем с помощью раствора аммиака изменяли pH среды. Благодаря этому зоны фосфатазной активности на геле становятся красными. Поскольку фенолфталеин легко диффундирует в геле, то учет изоферментных спектров фермента производят в первые 30 мин после их проявления.
Оказалось, что кислая фосфатаза является гетерогенным ферментом. Авторы предположили, что изоферментный спектр фосфатазы генетически обусловлен. Семейные обследования, проведенные D. Hopkinson и соавт., подтвердили правильность этого предположения и позволили авторам создать формально-генетическую модель наследования групп КФЭ, согласно которой в соответствующем генном локусе этой системы действуют три кодоминант- ных аутосомальных аллеля, обозначенных Ра, Ръ и Рс. Исходя из этого, система КФЭ имеет шесть фенотипов: три гомозиготны по соответствующим аллелям РА (генотип Р*/Ра), РВ (генотип Рь/Ръ) и РС (генотип Рс/Рс), три гетерозиготны – РАВ (генотип Ра/Рь), РАС (генотип Ра/Рс) и РВС (генотип Рь/Рс).
Среди английского населения, обследованного на полиморфизм КФЭ, выявлено только пять фенотипов фермента РА, РАВ, РВ, РАС и РВС, наиболее распространенным оказался РВ, затем РАВ, РА, РВС и РАС. Это доказывало, что в генном локусе этой системы чаще встречается аллель Ръ, потом Ра, аллель Рс обнаруживается нительно редко, вследствие чего в первых семейных дованиях не была выявлена его гомозиготная форма Рч (фенотип РС). В дальнейшем полностью подтвердил правильность генетической концепции в отношении аллельной модели наследования групп КФЭ. Так, при следовании большого числа бразильских семей впервые был обнаружен ожидаемый фенотип РС у двух братьев родители которых имели гетерозиготный фенотип РВс. Частота встречаемости трех основных аллелей Ра, Рь и М среди населения земного шара составляет в среднем соответственно 35, 60 и 5%, причем аллель Рс в негроидных и монголоидных популяциях встречается еще реже, а иногда вообще отсутствует.
Как и в большинстве других генетических детерминированных системах крови человека, в генном локусе системы КФЭ были найдены редкие атипичные аллели, обусловливающие появление необычных фенотипов. К ним относятся аллели Рт и Pd, идентифицированные сначала только у негров. Редкость подобных аллелей настолько велика, что до сих пор не выявлен ни один человек, генотипически гомозиготный по одному из этих двух атиничных аллелей, поэтому все необычные фенотипы фермента являются гетерозиготными по атипичному и одному из основных аллелей КФЭ. Атипичные гетерозиготные фенотипы КФЭ впоследствии наблюдались и среди европеоидов. Так, наследственная передача, атипичных фенотипов РДА и РДВ прослеживалась в некоторых датских и шведских семьях, а редкие варианты PRA и PRB выявлены среди немцев.
На рис. 13 представлены изоферментные спектры основных и трех атипичных фенотипов КФЭ. Из него видно, что аллель Рт обусловливает появление наиболее быстрых анодных, а аллель Рл наиболее медленных, мигрирующих к катоду изоферментов КФЭ. По мнению большинства исследователей, для выявления атипичных вариантов КФЭ, возникновение которых обусловлено действием атипичного аллеля Pd, необходимо соблюдать определенные условия проведения электрофореза.
Рис. 13. Схематическое изображение фенотипов кислой фосфатазы эритроцитов. А, АВ, В, СА» СВ, С – основные фенотипы; НА, RB, ДВ – атипичные фенотипы.
Многие авторы отмечали также, что при электрофоретическом исследовании по D. Hopkinson и соавт. (1963) с использованием прерывистой трис-янтарно-цитратной буферной системы дифференцировать фенотипы РСВ и РС очень трудно.
Для получения более четкого изоферментного спектра КФ G. Radam и Н. Strauch (1966) рекомендуют при электрофорезе использовать прерывистую фосфат-цитратную буферную систему с pH 6,0: гелевый буфер – 0,012 М фосфатного буфера (1,43 г КН2Р04 + 0,56 г NaHP04 * 12 Н20 в 1 л дистиллированной воды);, электродный буфер – 0,4 М цитратного буфера [105,5 г трехзаме- щенного цитрата натрия (гидрат) 8,6 г лимонной кислоты (моногидрат) в 1 л дистиллированной воды]. Наилучшее разделение* азофермеитов КФЭ (особенно между зонами В и С) достигается когда в электродные ванны заливают переходный буфер различной концентрации: 0,4 М на аноде, 0,1 М на катоде. Некоторые авторы для выявления групповых изоферментов КФЭ рекомендует использовать непрерывную буферную систему pH 5,0: на электродах 0,2 М муравьиная кислота и 0,23 М NaOH, в качестве клевого буфера – переходный буфер с дистиллированной водой 1:10.
Генетически обусловленный полиморфизм системы КФЭ уже давно используется в судебно-медицинских экспертизах по делам о спорпом отцовстве: значительная Полиморфность системы позволяет исключить довольно высокий процент мужчин, ложно указанных в качестве отца. Весьма благоприятная частота встречаемости основных аллелей системы КФЭ, особенно среди европеоидных популяций, позволяет исключить только по одной этой системе 23,23% мужчин европеоидной расы, не являющихся фактическими отцами для негроидных и монголоидных популяций эта величин составляет соответственно 15,88 и 12,40%. Редкие фенотипы этой ферментной системы, выявляемые у ребенка и его предполагаемого отца, по мнению большинства генетиков и судебных медиков, позволяют эксперту утверждать, что предполагаемый отец является действительным отцом ребенка.
Судебно-медицинским экспертам необходимо помнить и о существовании в генном локусе этой системы относительно редкого «немого» аллеля Р°, поскольку он может давать картину мнимой гомозиготности Ра/Ра, Pb/Pbt Рс/Рс) при истинной гетерозиготности (Ра/Р°, РЬ1Р\ Рс/Р°). Впервые наследственную передачу этого аллеля наблюдали J. Herbich и соавт. (1970) в одной австрийской семье. Эти авторы в 1972 г. сообщили о проявлении фосфатазного аллеля Р° еще в одной австрийской семье. В обеих семьях были лишь гетерозиготные формы Р°/Ра, Р°/Ръ и Р°/Рс, кровь их носителей хотя и давала электрофоретическую картину обычных гомозиготных фенотипов РА, РВ и РС, но характеризовалась сниженной на 40–46% активностью КФЭ. В настоящее время описано уже много семей с наследственной передачей «немого» аллеля Р°. Предполагают, что этот аллель встречается не так редко. Позднее семьи, в которых прослеживалась передача аллеля Р°, наблюдал P. Nezbeda (1979).
Случай, описанный P. Nezbeda (1979), особенно поучителен для судебных медиков, использующих полиморфную систему КФЭ в экспертизах спорного происхождения детей. Автор обнаружил семью, в которой отец имел фенотип РС, а мать – РАВ. По всем генетическим законам, учитывающим простой аутосомальный и кодоминантный порядок наследования групп КФЭ, у такой родительской пары могли родиться дети только с двумя возможными фенотипами РАС и РВС. Однако в этой семье было четверо детей с фенотипами РА, РВ, РА и РАС, т. е. по фенотипам КФЭ трех первых детей отцовство мужа относительно этих детей должно было быть исключено. Поскольку в данном случае не было никаких сомнений в том, что все четыре ребенка родились от данной супружеской пары, было высказано предположение о наследственной передаче «немого» аллеля Р° (это и было доказано с помощью количественного анализа активности КФЭ у отца и трех первых детей).
Гемолизаты эритроцитов отца и трех первых детей подвергали электрофорезу на ПААГ (7%) в цитратно-фосфатном буфере pH 5,9. Интенсивность окрашивания групповых изоферментов оказалась ниже, чем у матери и четвертого ребенка. Для того чтобы доказать действие в этой семье аллеля Р° и его наследственную передачу от гетерозиготного по этому аллелю отца (Р°/Рс) первым трем также гетерозиготным детям (Р°/Ра, Р°/Рь и Р°/Ра), активность КФЭ определяли с помощь количественного метода. Активность выражали в количестве свободного п-нитрофенола на 1 г гемоглобина (в микромолях), образовавшегося в течение 30 мин при 37 °С. Снижение активности КФЭ (в процентах) при гетерозиготных фенотипах Р°/Рс, Р°/Ра и Р°/Ръ определяли по средней активности КФЭ, обусловленной соответствующими аллелями Р\ Ръ и Рс в гомозиготной форме. По данным D. Hopkinson и соавт. (1963), эта величина составляет для РА 122,4 мкмоль, для РВ мкмоль и рС 256,3 мкмоль п-нитрофенола.
Для обследованной семьи получены следующие результаты: отец – фенотип РС 115 мкмоль (норма 256 мкмоль), 1-й ребенок – фенотип РА 70 мкмоль (норма мкмоль), 2-й ребенок – фенотип РВ 81 мкмоль (норма 188,3 мкмоль), 3-й ребенок – фенотип РА 56 мкмоль (норма 122,4 мкмоль), мать – фенотип РАВ 156 мкмоль (норма 155,3 мкмоль), 4-й ребенок – фенотип РАС 178 мкмоль (норма 186,2 мкмоль). Таким образом, точный количественный учет активности КФЭ У всех членов данной семьи отчетливо продемонстрировал резкое снижение (с 48 до 57%) этого показателя У якобы фенотипически гомозиготных по типам КФЭ отца и первых трех детей при нормальной (или почти нормальной) активности фермента у действительно фенотипически гетерозиготных матери и ее четвертого ребенка.
P. Nezbeda наблюдал наследственную передачу аллеля Р° и в следующем поколении описанной выше семьи. Первый ребенок – дочь, имевшая якобы гомозиготный фенотип РА и вышедшая замуж за мужчину с гомозиготным фенотипом РВ, должна бы иметь детей (если бы она на самом деле была гомозиготной Ра/Ра) только с фенотипом РАВ. Одиако у нее родились двое детей с фенотипом РВ, причем активность КФЭ у детей равнялась 84 и 80 мкмоль (норма 188,3 мкмоль). Это доказывает наследственную передачу аллеля Р° от гетерозиготной по этому аллелю матери (Р°/Ра) двум также гетерозиготным (Р°/Ръ) детям.
Все эти обстоятельства должны всегда учитывать судебно-медицинские эксперты, использующие генетически детерминированный полиморфизм этой эритроцитарной ферментной системы в экспертизах спорного происхождения детей. Во всех случаях «исключения» возможности рождения ребенка от конкретной родительской нары (имеется в виду «противоположная» гомозиготность по типам КФЭ у предполагаемого отца и ребенка, а также ребенка и его матери) эксперт должен обратить внимание в первую очередь на выраженность групповых изоферментных спектров у ребенка и его предполагаемого отца (или матери). Резкое снижение такой выраженности может свидетельствовать о наследственной передаче «немого» аллеля Р°. В подобных случаях необходимо проводить количественный анализ фосфатазной активности эритроцитов крови не только у всех проходящих по делу лиц, но и (если это возможно) у их ближайших родственников.
