Система щелочной фосфатазы сыворотки крови человека
Сывороточная щелочная фосфатаза (КФ 3.1.3.1) катализирует реакцию присоединения Н2О к моноэфиру ортофосфорной кислоты, в результате которой образуются спирт и ортофосфат. Этот фермент характеризуется высокой органной и тканевой специфичностью. Boyer (1963) с помощью электрофореза и иммунной абсорбции специфической антиферментной сывороткой выявил меж- и внутриорганные антигенные подклассы щелочной фосфатазы. В 1-й подкласс Рр входят тканевые фосфатазы печени, костей, почек и селезенки, во 2-й – щелочная фосфатаза кишечника и в 3-й – щелочная фосфатаза плаценты при беременности. Ферменты 2-го и 3-го подклассов часто дают перекрестные реакции.
Изоферменты Рр, выявляемые в плазме (или сыворотке) крови человека, имеют печеночное, костное и интестинальное, а изоферменты при беременности – плацентарное происхождение [Warnock М., 4966].
К. Arfors и соавт. (1963), используя электрофорез в крахмальном геле с последующим выявлением активности изоферментов СЩФ, обнаружили две генетически обусловленные группы Рр1 и Рр2. Группа Рр1 характеризовалась одним быстро мигрирующим к аноду изоферментом А, имеющим печеночное или костное происхождение, а группа Рр2 – двумя изоферментами А и В; изофермент В, обладающий меньшей скоростью миграции к аноду, имел интестинальное происхождение. Изофермент А, присутствующий, как правило, во всех образцах сыворотки крови, лод действием нейроаминидазы теряет электрофоретическую подвижность, что обусловлено редукцией остатков сиаловой кислоты. Изофермент В, встречающийся в крови людей различных популяций с разной частотой, специфически ингибируется L-фенилаланином его электрофоретическая подвижность не изменяется при действии нейроаминидазы.
Интенсивность проявления на электрофореграммах изофермента В в различных образцах сывороток крови группы Рр2 может значительно изменяться. Более того, она может быть разной в образцах сыворотки, взятых у одного и того же лица в различное время. Иногда наблюдались дополнительные фракции в зоне А, что, по-видимому, обусловлено дефицитом сиаловой кислоты.
М. Langman и соавт. (1966) установили, что активность изофермента В группы Рр2 может значительно возрастать при потреблении жирной пищи. При этом у некоторых людей, предварительно классифицируемых исключительно по типу фосфатазы Рр1 (зона А), отмечалось повышение ферментативной активности в зоне В, что могло привести к ошибочной интерпретации фосфатазной группы Рр2. Однако в таких случаях маскировку истинного фенотипа Рр1 «жировым» изоферментом В, характерным для фенотипа Рр2, можно легко обнаружить с помощью обработки L-фенилаланином, который тормозит активность истинно кишечного изофермента В группы Рр2 и не снижает активность «жирового» изофермента В группы Рр1. Это нужно учитывать при интерпретации фенотипов Рр как в популяционно-генетических и семейных исследованиях, так и в судебно-медицинских экспертизах, особенно при использовании генетически детерминированного полиморфизма этой сывороточной ферментной системы в экспертизах спорного происхождения детей.
Характер наследования групп СЩФ довольно сложный, некоторые детали этого механизма до конца не выяснены, что, безусловно, затрудняет использование полиморфизма Рр в судебно-медицинских экспертизах. Более того, многочисленные семейные обследования, проведенные в различных в расовом отношении популяциях, свидетельствуют о возможности рождения детей с группой Рр2 в семьях, в которых оба родителя имеют группу Рр1, и наоборот. Такие данные на первый взгляд свидетельствуют о невозможности использования групп Рр1 и Рр2 в качестве генетических маркеров при решении вопроса о возможности или невозможности рождения ребенка от конкретной родительской пары. Однако особенности генетической корреляции полиморфизма системы СЩФ со многими изосерологическими системами крови человека [АВ0 (Н), Льюис, Даффи] и особенно с генетически детерминированной системой выделительства (Se-se), по-видимому, изменят это сложившееся мнение.
К. Arfors и соавт. (1963) обратили внимание на определенную корреляцию групп Рр1 и Рр2 с системой АВ0 (Н), что свидетельствовало о тесном сцеплении генных локусов, аллели которых обусловливают полиморфизм этих систем. Эта корреляция проявлялась в том, что в эритроцитах у подавляющего числа лйц с фенотипом Рр2 не было антигена А системы АВ0 (Н), т. е. эти люди имели группы крови О (I) или В (III). В то же время фенотип Рр1 почти всегда наблюдался у людей, имеющих в эритроцитах антиген А, т. е. относящихся к группам A1, А2, AiB или А2В. Эту же безусловно тесную, но не абсолютную положительную генетическую корреляцию аллелей, контролирующих реализацию антигенов Ai и А2 системы АВ0 (Н) и фенотипа Рр1, наблюдали также Т. Т. Сорокина, JI. В. Богданов (1973), В. А. Спицын, О. В. Ирисова, И. В. Перевозчиков (1976), В. А. Спицын i(i1978), L. Beckman (1964) и другие авторы у представителей различных этнических групп. Например, при обследовании 626 не связанных родством жителей г. Москвы А. С. Гладких и Д. Г. Гадакчян (1973) выявили 174 человека с фенотипом Рр2, у 86,2% из этих лиц (86,2%) в эритроцитах не было антигенов A1 и А2, т. е. они имели группы крови 0(1) или В (III). Полученные данные подтверждают отмеченную ранее положительную корреляцию фосфатазного компонента В, обусловливающего фенотип Рр2, с группами крови О и В и отрицательную корреляцию – с группами А и АВ.
Для практического использования генетически обусловленной системы выделительства в судебно-медицинских экспертизах спорного происхождения детей большое значение имеет тесная связь групп Рр1 и Рр2 с изосерологической системой Льюис и феноменом выделительства. При изучении возможных корреляций между полиморфизмом сывороточной щелочной фосфатазы и другими генетически обусловленными маркерами крови человека К. Arfors и соавт. (1963) отметили, что ни у одного лица с группой крови Le (a+b–), являющихся невыделителями групповых субстанций АВН, не было группы Рр2 и нее они имели группу Рр1. Авторы предположили, что существует тесная связь группы Рр1 и Рр2 не только с системой Льюис, но и системой выделительства групповых субстанций АВН.
L. Beckman (1964) на обширном семейном материале включающем обследования 1307 шведов, доказал абсолютную корреляцию в наследственной передаче аллеля Рр2, контролирующего появление в сыворотке крови изофермента В, характерного для группы Рр2, и аллеля Se, обусловливающего выделительство групповых субстанций АВН системы АВО (Н).
Помимо двух основных электрофоретических фенотипов СЩФ, описаны случаи наследственной передачи атипичных фенотипов, электрофоретическая картина которых представлена на рис. 21 (см. стр. 218). С. Воloux и соавт. (1972), исследуя полиморфизм СЩФ у негритянского населения Сенегала, выявили необычный электрофоретический фенотип фермента, характеризующийся наличием только одного изофермента РрВ. Эта изоформа СЩФ была обнаружена в двух поколениях некоторых семей, что доказывало генетическую обусловленность изофермента. По аналогии с другими двуаллельными генетическими системами, полиморфизм которых выявляется с помощью электрофореза (в гомозиготных фенотипах один, а в гетерозиготных два компонента), авторы назвали этот фенотип Рр(2_2), а два обычных фенотипа Рр1 и Рр2 соответственно обозначили Pp(i-1) 0 Рр<2-1). Однако, если допустить, что фенотип Pp(i-i) является генотипически гомозиготным Рр'/Рр1, а фенотип Рр (2-1) – генотипически гетерозиготным Рр1/Рр2, то, исходя из частоты встречаемости двух основных фенотипов системы СЩФ, трудно объяснить крайне низкую частоту встречаемости гомозиготного фенотипа Pp<2). По мнению некоторых исследователей (В. А. Спицын, 1978, и др.), генетическая интерпретация таких атипичных фенотипов станет возможной, лишь когда накопятся подробные генетические и, возможно, клинические данные о носителях этих фенотипов.
Тем не менее атипичные варианты Рр обозначали в соответствии с гипотезой С. Bouloux и соавт. (1972) о генотипической гетерозиготности фенотипа Pp(2-i): Рр<8-1), Рр(*-2), Рр<4-2) И Т. д. (см. рис. 21).
Высокая частота встречаемости фенотипа Рр2 (25–30%) при отсутствии «вариантного» фенотипа Рр<2-2)
(что наблюдается в европеоидных популяциях) ставит под сомнение правильность предположения С. Bouloux й соавт. (1972) о том, что основные фенотипы СЩФ Рр1 и Рр2, а также атипичный фенотип Рр(2-2) обусловлены действием двух кодоминантных аллельных генов Рр1 и Рр2. Скорее всего, в генном локусе этой системы действуют два основных аллеля щ доминантный Рр2, генетически реализующий изофермент В, характерный для фенотипа Рр2, и антитетический по отношению к нему рецессивный аллель Рр, который не реализует появление изофермента В. В таком случае следует признать, что фосфатазный изофермент А, выявляемый почти во всех образцах сывороток крови, является генетическим продуктом какого-то структурального аллеля в другом моно- морфном генном локусе сывороточной щелочной фосфатазы (аллеля Рр1). Исходя из этого, основной фенотип Рр1 генотипически является гомозиготным по широко распространенному рецессивному аллелю Рр (Рр/Рр), а фенотип Рр2 ;либо гетерозиготным (Рр2/Рр), либо гомозиготным (Рр2/Рр2), причем в последнем случае выраженность изофермента В в сыворотке крови значительно выше. Полученные отечественными авторами данные [Гладких А. С., Гадакчян Д. Г., 1973] подтверждают эту гипотезу и согласуются с результатами К. Bamford и соавт. (1965), которые подразделили всех людей на три фенотипа СЩФ: Р° (Рр1, генотип Рр/Рр), Р+ (Рр2, генотип Рр2/Рр) и Р++ (Рр2, генотип Рр2/Рр2).
По нашему мнению, для судебно-медицинских экспертов, пытающихся использовать в экспертизах спорного происхождения детей генетически обусловленную систему Se-se, большой интерес представляет абсолютная генетическая корреляция аллеля Рр2 с аллелем Se генного локуса системы выделительства. Такая связь свидетельствует, во-первых, о тесном сцеплении генных локусов систем Рр и Se-se и, во-вторых, о гаплотипичном порядке наследования аллелей двух тесно сцепленных локусов. Данные многочисленных семейных и популяционно-генетических обследований показывают, что существуют три основных гаплотипа этих тесно сцепленных систем (PpSe, Ppse и Pp2Se) и отсутствует гаплотип Pp2se.
Такая генетическая интерпретация позволяет, правда, признать возможность рождения в родительских парах Рр2ХРр2 детей с фенотипом Рр1», но не наоборот, как это наблюдается в действительности. Поэтому до окончательного выяснения всех тонкостей генетических взаимосвязей этой сывороточной ферментной системы изолированное использование ее полиморфизма в судебно-медицинских экспертизах в делах о спорном происхождении детей невозможно. Однако, абсолютная корреляция фосфатазного фенотипа Рр2 с феноменом выделительства открывает возможности использования групп Рр в качестве незаменимого генетического признака, позволяющего применять в таких экспертизах полиморфизм генетически детерминированной системы Se-se.
Известно, что категории выделительства и невыделительства групповых антигенов АВН системы АВ0 (Н) генетически обусловлены и, следовательно, передаются по наследству. Однако применение на практике системы выделительства в экспертизах спорного отцовства встречается с определенными трудностями. Принадлежность того или иного лица к выделителям или невыделителям антигенов АВН определяют по выраженности этих антигенов в слюне; этот показатель значительно варьирует даже в пределах одного и того же фенотипа (Se и se). Кроме того, в настоящее время высокочувствительными методами абсорбции – элюции и «смешанной» агглютинации в слюне любого невыделителя можно выявить агглютиногены системы АВ0, соответствующие его группе крови, что объективно затрудняет дифференцирование двух этих генетически детерминированных категорий выделительства.
Антигены системы Льюис, также непосредственно коррелирующие с системой выделительства при их онтогенетической сформированности, во многих случаях позволяют определить, является ли определенное лицо выделителем или невыделителем групповых антигенов системы АВ0 (Н). Известно, что лица с группой крови Le(a + b–) являются невыделителямй, а с группой крови (Le(a–b + ) – выделителями групповых антигенов АВН. Лица, имеющие фенотип Le(a–b–), могут быть как выделителями, так и невыделителями групповых антигенов системы АВ0(Н). Из этого следует, что и по изосерологической системе Льюис, если нет довольно дефицитных сывороток анти-Le (с) и анти-Le (d), не всегда можно определить генетически детерминированную категорию выделительства или невыделительства. Главным же препятствием, затрудняющим использование системы Льюис в экспертизах спорного отцовства, является позднее онтогенетическое формирование ее групповых антигенов в эритроцитах.
По нашему мнению, генетически обусловленную систему выделительства в экспертизах спорного отцовства можно использовать лишь в следующем виде. Первый этап – исследование категорий выделительства у всех проходящих по делу лиц по выраженности групповых антигенов АВН в слюне, применяя при этом количественный метод абсорбции агглютининов и ни в коем случае не используя методы абсорбции – элюции или «смешанной» агглютинации. Если в слюне ребенка групповые антигены системы АВ0(Н) выявляются отчетливо, а в слюне его матери и ответчика либо не выявляются совсем, либо очень незначительно (1–2 ступени снижения титра абсорбированных сывороток), то обязательно проводят второй этап исследования – установление фенотипов системы Льюис у ответчика и матери ребенка. Принадлежность их к группе Le(a+b-r^) подтверждает и принадлежность к генетически детерминированной системе невыделительства групповых антигенов АВН, а принадлежность к группе Le(a–b–) не исключает такой возможности. Однако и в том и в другом случае подобные исследования не позволяют исключить отцовство ответчика. Такое исключение может быть произведено лишь после определения групп СЩФ у ребенка, матери и предполагаемого отца, причем только в том случае, если ответчик и мать ребенка имеют фенотип Рр1 (могут быть невыделителями!), а ребенок – фенотип Рр2 (только выделитель!).
На первый взгляд это выглядит парадоксально, поскольку многочисленные наблюдения свидетельствуют о возможности рождения детей с фенотипом Рр2 у родителей с фенотипом Рр1. Так, L. Beckman (1964) наблюдал 119 семей, в которых оба родителя имели фенотип Рр1, причем из 444 родившихся в этих семьях детей 50 имели фенотип Рр2, характерный для выделителей. При обследовании родителей этих 50 детей на категории выделительства [определялась выраженность антигенов АВН системы АВ0(Н) в их слюне и исследовались группы системы Льюис, оказалось, что либо отец, либо мать, либо оба родителя являлись выделителями групповых антигенов АВН. Были найдены еще 5 семей с 24 детьми, в ко-
торых оба родителя являлись невыделителями и имели фенотип Рр1, причем все дети в этих семьях также был невыделителями и имели фенотип Рр1.
Перспектива использования полиморфизма СЩФ в_судебно-медицинских экспертизах спорного отцовства имеет достаточно объективные предпосылки. Однако прежде чем рекомендовать применение групп Рр в качестве генетического признака, сцепленного с феноменом выделительства, мы проверили, действительно ли группа Рр2 свидетельствует о выделительстве по системе АВ0(Н) и каковы сроки онтогенетического формирования фосфатазных групп [Гладких А. С., Гадакчян Д. Г., 1973].
Из 174 лиц с фенотипом Рр2 у 455 мы выявили группу Le (а–Ь+) , что свидетельствовало о принадлежности их к выделителям. У 19 других людей был фенотип Le (а–b–), однако при исследовании их крови сыворотками анти-Le (с) и анти-Le (d) было установлено, что все они имели фенотип Le(d-f-), т. е. также являлись выделителями групповых антигенов системы АВО(Н). Таким образом, группа Рр2 встречается только у выделителей.
Для того чтобы установить, обладают ли новорожденные полностью сформированной, собственной, а не материнской, группой Рр, исследовали сыворотку крови 40 пар мать – ребенок. В 32 случаях фосфатазные группы ребенка и его матери совпадали (в 23 парах – группа Рр1 и в 9 парах – группа Рр2), а в 8 случаях наблюдалась дискордантность, свидетельствующая о полной онтогенетической сформированности групп Рр к моменту рождения ребенка.
Для электрофоретического разделения групповых изоферментов Рр в крахмальном геле наиболее эффективной оказалась буферная система следующего состава. Раствор № 1: 1,2 г гидроксида лития и 11,9 г Н3ВО3 в 1 л дистиллированной воды, pH 8,6. Раствор № 2: 1,6 г лимонной кислоты и 6,3 г триса в 1 л дистиллированной воды, pH 8,6. Электродный буфер: раствор № 1, гелевый буфер: 1 часть раствора № 1 и 9 частей раствора № 2. Электрофорез проводили в 13% крахмальном геле при напряжении 13–15 В/см в течение 3 часов при 4° С. Ферментативную активность выявляли по методу К. Arfors и соавт. (1963). Инкубационная смесь: 100 мл ацетатного 0,1 М буфера pH 5,6, содержащего по 100 мг а-нафтил-фосфата и прочной гранатовой GBC-соли, по 10 капель 10% раствора MgCl2 и МпС12, 0,5 г поливинилпирролидона и 2 г NaCl. Инкубацию проводили 3 ч при 37° С. Фореграмму в течение 12 ч обрабатывали в смеси: вода метанол ледяная уксусная кислота в соотношении 5:5:1.
