Система трансферрина
Трансферрин (Tf), или сидерофилин, по электрофорез ческой подвижности относится к pi-глобулинам.
Впервые полиморфизм сывороточного трансферрина выявил О. Smithies (1957). Большинство людей обладало типом С, но иногда встречались типы В и D. Семейные обследования доказали генетическую обусловленность этих вариантов. Онтогенетически трансферрин формируется рано, поскольку его обнаруживали у плодов на сравнительно ранних стадиях развития. У новорожденных он полностью сформирован.
До последнего времени считали, что у подавляющего большинства людей имеется только один тип трансферрина – TfC, генотипически характеризующийся гомозиготной комбинацией по чрезвычайно распространенному основному аллелю Tfc в генном локусе этой сывороточной системы; другие же трансферрины, являющиеся гетерозиготной формой по основному аллелю Tfc и по какому- нибудь атипичному аллелю этой системы, из-за крайней редкости этих атипичных аллелей (особенно у европеоидных популяций) встречаются чрезвычайно редко. Атипичные трансферрины, мигрирующие быстрее, чем TfC чаще наблюдаются у европеоидов, а трансферрины, электрофоретическая подвижность которых меньше чем у TfC, – в негроидных популяциях.
Даже в своей последней монографии «Группы крови человека» (1976) О. Prokop и W. Gohler отмечали, что «поскольку сывороточная система трансферринов мало пригодна для практического применения в судебно-медицинских исследованиях, проводимых в делах о спорном отцовстве, то в европейских странах генетическим взаимосвязям этой системы придается сравнительно небольшое значение». Действительно, атипичные, «вариантные», формы трансферринов, отличные от обычного типа TfC, при исследовании их с помощью электрофореза составляли для большинства европейских популяций очень низкую величину – около 1% и меньше. Естественно, что информативность этой системы для исключения мужчины, ложно указанного в качестве отца ребенка, была крайне низкой. Так, по данным Е. Giblett (1962) и A. G. Steinberg,. J. Matsumoto (1964), вероятность исключения отцовства; по системе Tf с учетом трех аллелей Tfc, Tfb и Tfd составляла: для европеоидов 0,64%, монголоидной популяции 0,79% и для негроидной популяции 4,1%.
P. Kiihnl и W. Spielmann (1978), используя метод изоэлектрического фокусирования в полиакриламидном геле с последующей иммунной фиксацией, смогли доказать, что в генном локусе системы Tf находится не один, как полагали ранее, чрезвычайно распространенный обычный аллель Tfc, а два обычных аллеля – Тщ и Tfc2.
Благодаря этому все ранее относящиеся к типу TfG образцы можно было легко подразделить на три общих фенотипа, характеризовавшихся либо одним быстрым трапсферриновым компонентом С, либо одним медленным TfG-компонентом, либо двумя этими компонентами вместе. Три новых фенотипа трансферрина обозначили соответственно TfOl, TfC2, TfC2-l.
Семейные обследования, проведенные рядом авторов, без сомнения, свидетельствовали о генетической обусловленности и наследственной передаче трех фенотипов Tf. На основании полученных данных предложена новая двуаллельная формально-генетическая модель наследования типов сывороточных трансферринов. Согласно этой модели, в едином аутосомальном генном локусе данной системы действуют два обычных, или основных, кодоминантных аллеля Tfcl и Tfc , реализующих появление двух гомозиготных (TfCl, TfC2) и одного гетерозиготного (TfC2-l) фенотипов. На основании исследования фенотипов трансферрина среди 942 не связанных родством жителей ФРГ P. Ktihnl и W. Spielmann (1978) вычислили генные частоты встречаемости аллелей Tf: для аллеля Tf1 81,95%, для аллеля Tfc2 17,2%, для аллеля Tf2 0,64%, для аллеля TfbX~% 0,05%.
М. Thymann (1978) доказала, что групповую идентификацию различных вариантов трансферринов можно провести не только методом изоэлектрического фокусирования в ПААГ с последующей иммунной фиксацией, но и Другими высокочувствительными иммунологическими и разделительными методами, такими, например, как двойная диффузия в 1% геле агарозы и метод перекрестного или двумерного иммуноэлектрофореза. Однако, по мнению автора, наилучшие и, самое главное, воспроизводимые результаты достигаются при использовании метода изоэлектрофокусирования с последующей иммунной фиксацией компонентов трансферрина соответствующей анти- трансферриновой сывороткой.
P. Ktihnl и соавт. (1979), помимо исследования «подтипов» TfC, изучили наследственную передачу редких аллелей этой системы у 90 лиц, имевших разновидности атипичных аллелей Tfb И Tfd. Все обследованные были гетерозиготными по атипичному аллелю и одному из основных аллелей Tfcl или Tfc . На изоэлектроф сической фореграмме трансферринов 90 гетерознготных лиц TfCB и TfCD, кроме атипичного трансферринового компонента, выявлялся только один обычный компонента pi-глобулина, реализующийся под действием одного И3 основных аллелей Tfcl или Tf2 . Все это свидетельствовало в пользу генетической гипотезы, согласно которой атипичные, «вариантные», гены, являющиеся разновидностями генов Tfb и TfA, представляют собой, по-видимо- му, аллели к основным генам Tfcl и Tf°2 этой генетической системы. Кроме того, нахождение атипичных гомо- и гетерозиготных вариантов трансферрина, таких как тип TfB2 (генотип или TfB2D2 (генотип Tfb2/Tfd2 ), не имеющих трансферриновых компонентов в зоне TfC, доказывало существование на соответствующих хромосомах единого генного локуса системы Tf, а не отдельных, тесно сцепленных генных локусов (например, TfC, TfB, TfD) с ди- или более аллельным полиморфизмом. Этим доказывалось также отсутствие комплексного гаплотипичного порядка наследования аллелей системы Tf, как это имеет место в групповых системах MNSs, Rh, Gm, HLA и Ag.
He прошло и года с тех пор как P. Ktihnl и W. Spielmann (1978) с помощью изоэлектрического фокусирования в ПААГ и последующей иммунной фиксации открыли два новых основных аллеля Tfcl и TfcZ в генном локусе системы Tf, как появилось новое сообщение этих же исследователей о наличии в генном локусе этой системы уже не двух (Tfcl и Tfc ) а трех основных аллелей: Tfcl, Tfc2} и Tfc3. Авторы обнаружили, что трансферриновый компонент, ранее считавшийся генетическим продуктом аллеля Tfcl, по своей изо- электрической подвижности не является однородным, а подразделяется во многих образцах сывороток крови на два компонента. Один из них по изоэлектрической подвижности полностью совпадает с обычным компонентом TfCl, антигенно реализующимся под действием соответствующего аллеля Tfcl, а другой несколько отличается от компонента TfCl и изоэлектрическая точка его располагается между изоэлектрическими точками трансферриновых компонентов TfCl и ТfС2.
Исследования проводили на 252 не связанных родством жителях ФРГ, а новая формально-генетическая гипотеза наследования сывороточных трансферринов была проверена (и подтверждена) при анализе 25 семей с 51 ребенком. Для изоэлектрического фокусирования использовали ПААГ-пластины размером 245Х115ХОД мм, покрытые тончайшей резиновой пленкой. Для полимеризации полиакриламидного геля (общим объемом 11,52 мл) применяли смесь, состоящую из 2,4 мл 29,1% раствора акриламида (масса/объем), 2,4 мл 0,9% раствора N1, N'-метиленбисакриламида (масса/объем), 5,0 мл 20,5% раствора сахарозы (масса/объем), 0,7 мл глицерина, 0,6 мл амфолина, содержащего амфолиты в пределах (pH 5–7), 20 мкл ТЭМЕД (N-тетраметилэтилендиамин) и 0.4 мл 1% раствора персульфата аммония (масса/объем).
После 20-минутной полимеризации геля при комнатной температуре на гель непосредственно перед внесением в него проб накладывалась максимальная электрическая нагрузка в течение 30 мин (1800 В, 50 мА, 20 Вт). Неразведенные образцы сывороток крови в количестве 5 мкл помещали на кусочки фильтровальной бумаги размером 5X7 мм в 2,5 см от катодного края геля. Спустя 30 мин после начала изоэлектрофокусирования кусочки бумаги удаляли из геля и фокусирование продолжали. Дальнейшую иммунную фиксацию и окрашивание геля кумасси блю R250 проводили по описанному выше методу P. Ktihnl и W. Spielmann (1978).
При pH 4–6,5 амфолитов ПААГ выявление трансфер- риновых компонентов возможно в двух областях, распо- женных как к аноду, так и к катоду от стартовых лунок, однако только в анодной области обнаружен новый полиморфизм компонентов в зоне С. 0то позволяет подразделить их на три фракции: TfCl, TfC2 и TfC3. После изоэлектрического фокусирования на ПААГ-пластинах, содержащих амфолиты при pH 3,5–9,5, можно было выявить только три основных фенотипа трансферрина: TfGl, TfC2-l и TfC2. Пролонгированное изоэлектрическое фокусирование на пластинах, содержащих амфолиты при pH 4–6,5, позволило авторам обнаружить среди лиц с тремя основными фенотипами (TfGl, TfC2-l и TfC2) еще три новых, дополнительных фенотипа: обозначенных TfC3-l, TfC3-2 и TfC3.
Таким образом, изменив методику изоэлектрофокусического исследования, P. Kxihnl и W. Spielmann доказали еще большую полиморфность генетически детерминированной системы сывороточного трансферрина и вполне логично высказали предположение о существовании в генном локусе этой системы не двух основных аллелей Tfcl и 7ус2, а трех основных аллелей: Tfcl, Tfc2 и Г/с3. На рис. 8 представлена диаграмма шести основных фенотипов трансферрина, выявленных методом пролонгированного изоэлектрического фокусирования при pH 4,0–6,5. Она убедительно демонстрирует, что полная «шестифенотипная» полиморфность трансферринов может быть обнаружена только в анодной по отношению к старту части по- лиакриламидного геля, имеющей pH в пределах 5,5–5,7. В прежней катодной зоне полиакриламидного геля с pH 5,9–6,2 можно практически выявить лишь три фенотипа трансферрина TfCl, TfC2-l и TfC2. Пунктирными линиями на рис. 8 обозначены слабовыраженные трансферриновые компоненты, появление которых, так же как и основных компонентов в шести различных фенотипах Tf, обусловлено действием одного из трех основных аллелей tf % Tfci и TfcS в генном локусе этой системы.
Рис. 8. Диаграмма подтипов TfC после изоэлектрофокусирования на ПААГ-пластинах (pH 4–6,5). Полная полиморфность Tf (6 фенотипов: Cl, СЗ-1, СЗ, СЗ-2, С2-1, С2) наблюдается в анодной области pH 5,5–5,7. В прежней катодной области типизации Tf (pH 5,9–6,2) возможно выявление лишь трех фенотипов Tf (Cl, С2-1, С2).
Диаграмма трансферриновых компонентов показывает также, что в ранее рекомендованной для типизации групп трансферрина катодной части геля с pH 5,9–6,2 практически неразличимы фенотипы TfC3-2 и TfC2-l, а также фенотипы TfC3-d и TfGl. В анодной же части геля с pH 5,5-5,7 все шесть основных фенотипов трансферрина легко различимы. TfC3-l четко разделяется на два основных компонента, причем более анодный компонент обладает выраженностью основного компонента в гомозиготном фенотипе TfCl, а менее анодный совпадает с основным компонентом в гомозиготном фенотипе. Гетерозиготный фенотип TfC3-2 демонстрирует сложный набор трансферриновых компонентов, характерный для эквивалентной смеси образцов сывороток гомозиготных фенотипов TfC3 и TfC2.
Авторы смогли показать, что генотический продукт нового аллеля Tfc3 pi-глобулин TfC3 по изоэлектрической точке, оптимуму pH или изоэлектрической подвижности очень мало (приблизительно на 0,015 единиц pH) отличается от TfGl, генетически реализующегося под действием аллеля Tfcl. Кроме того, четкое выявление шести основных фенотипов трансферринов, каждый из которых отражает единственно возможную для него генотипическую комбинацию, возможно лишь на ПААГ-пластинах, насыщенных амфолитами в довольно узких пределах pH 4–6,5 или 6–1.
Частота встречаемости аллеля Tfc3 системы Tf, определенная при исследовании 252 не связанных родством жителей ФРГ, составила 4,2%. Анализ сывороток крови тех же 252 лиц позволил P. Kuhnl и W. Spielmann (1979) выявить семь трансферриновых фенотипов: шесть обычных (TfGl, TfC2-l, TfC2, TfC3-<l, TfC3-2, TfC3) и один «вариантный» (TfClB2). На основе частоты их распределения определена генная частотность для аллелей системы трансферрина: для аллеля Tfcl 79,5%, для аллеля Tf2 15,5%, для аллеля Tfc3 4,2%, для аллеля Г/ьа 0,8%. Описанные выше семейные обследования отчетливо показали простой аутосомальный кодоминантный порядок наследования как всех трех основных трансферриновых аллелей, так и «атипичного» аллеля Tf°2.
Использование «расширенного» генетически обусловленного полиморфизма сывороточной системы Tf в судебно-медицинских экспертизах спорного отцовства (с учетом наличия в генном локусе этой системы трех основных и множества редких «атипичных» аллелей) позволит повысить вероятность исключения ложно указанного в качестве отца мужчины только по одной этой системе с 0,64–1% при использовании различных электрофоретических методов (электрофорез в гелях крахмала, агарозы и полиакриламида) до 15,5 % при применении модифицированного метода изоэлектрического фокусирования на ПААГ-пластинах с последующей иммунной фиксацией.
Рис. 9 показывает, насколько расширились наши знания о генетике системы сывороточного трансферрина. Следовательно, возросли и экспертные возможности при использовании генетически обусловленного полиморфизма этой системы в судебно-медицинских экспертизах в делах о спорном происхождении ребенка с учетом применения различных аналитических методов исследования.
Рис. 9. Расширение возможностей типизации групп Tf при использовании различных методов разделительного анализа. SGE, AGE – методы электрофореза в геле крахмала и агарозы, PAGIF – метод изоэлектрического фокусирования на ПААГ-пластинах. Var – варианты TfB и TfD. Сегменты в круге отражают количество групп Tf и частоту их встречаемости среди населения земного шара.
Сочетание модифицированной методики P. Kiihnl и W. Spielmann (1979), позволяющей обнаруживать «расширенный» полиморфизм системы трансферрина, с методикой В. Hoste (1979), позволяющей неиммунологическим путем обнаружить полиморфизм системы Gc после изоэлектрического фокусирования на ПААГ-пластинах, даст возможность судебно-медицинским экспертам одновременно выявлять чрезвычайно широкий полиморфизм этих сывороточных систем в экспертизах спорного отцовства. Это повысит вероятность исключения мужчины, не являющегося фактическим отцом ребенка, сразу на 44,86% для обеих систем.
