Аппаратура для люминесцентного анализа и световой микроскопии
Долгое время вне области применения телевизионных методов была флюоресцентная микроскопия. Это объясняется относительно низким уровнем яркости свечения микропрепаратов, что требует использования телевизионных трубок чувствительностью не менее 10~2 лк. В настоящее время возможность создания телевизионного флюоресцентного микроскопа подтверждена рядом разработок. Так, фирмой «ЕМР Photoelectric» (Англия) создана телевизионная система с камерой на суперкремниконе с пороговой чувствительностью 3•10-7 лк, которая используется, в частности, для биолюминесцентного анализа.
Фирма «Siemens» (ФРГ) разработала камеру К5 для анализа слабого свечения при исследовании глазного дна; фирма «Westinhaus» изготовила камеру ЕТУ-616 с 16-миллиметровым суперкремниконом, которая применяется при спектральных исследованиях микроскопических объектов; «General Electrodinamix» (США) – камеру ЕД 7090 на суперкремниконе специально для флюоресцентных исследований в биологии. Автоматическая регулировка чувствительности последней камеры обеспечивает работу при изменении освещенности в 106 раз. Для изучения спектров флюоресценции разработан видеофлюориметр с телевизионной камерой «Quantex-16» на суперкремниконе РСА С21125.
Описано применение телевизионной техники в комплексе с микроскопом для целей цитодиагностики на основе автоматизированного флюоресцентного и абсорбционного цитохимического анализа. В этом комплексе «Leutas» (ФРГ) телевизионная система используется, в частности для воспроизведения изображения микропрепаратов в лучах флюоресценции, а также для оценки интенсивности флюоресценции отдельных клеток и отбора подозрительных по этому параметру клеток для последующего морфометрического абсорбционного анализа их текстуры.
Внедрение телевизионных систем высокой чувствительности во флюоресцентную микроскопию, кроме известных преимуществ, даваемых телевизионной техникой [13], позволяет решить одну из трудных и важных задач микрофлюориметрии – снижение ошибки измерения из-за фотовыцветания препарата, т. е. из-за изменения интенсивности свечения объекта, происходящего под действием возбуждающего света за время выбора места, препарата, его фокусировки и исследования. Использование метода фазового контраста для этой цели имеет некоторые недостатки, связанные в основном с особенностями изображения клеток при их наблюдении по методу фазового контраста, которое существенно отличается от изображения тех же клеток в свете флюоресценции; при переходе от фазового контраста к флюоресценции часто требуется подфокусировка. Кроме того, при исследовании фиксированного биологического материала микропрепараты, как правило, заключают в среды, показатели преломления которых мало отличаются от показателей преломления исследуемых структур. Это неизбежно снижает фазовый контраст и делает его недостаточно эффективным для целей поиска и выбора нужного места препарата. По указанным причинам целесообразнее наблюдать изображение клеток тем же методом, которым производится и их измерение, т. е. в свете флюоресценции, однако при этом необходимо значительно уменьшить дозу облучения препарата.
С завершением разработки и переходом к серийному выпуску высокочувствительных суперкремниконов типа ЛИ-702, ЛИ-703, ЛИ-704 появилась возможность создания высокочувствительной телевизионной аппаратуры для телевизионной микроскопии и у нас в стране. Суперкремниконы являются в настоящее время наиболее подходящими трубками для исследования флюоресценции, так как при относительно малых габаритах, достаточной простоте и надежности в эксплуатации они обладают чувствительностью, на несколько порядков превышающей чувствительность обычных видиконов и их разновидностей (плюмбиконов, кремниконов).
Для проведения многофункциональных микроскопических исследований флюоресцирующих процессов разработан экспериментальный образец высокочувствительной телевизионной системы (рис. 106). В качестве оптического микроскопа системы возможно использование приборов «Lttman-I» или «Luman-CF. В телевизионной камере системы на суперкремниконе ЛИ-702 оптическое изображение преобразуется в видеосигнал, который поступает в блок усиления и обработки. В нем производится полное формирование видеосигнала с замещением строчных и кадровых гасящих и синхронизирующих импульсов, сформированных в синхрогенераторе. Кроме того, блок усиления и обработки видеосигнала выполняет функцию усилителя распределителя. Сигналы черно-белого изображения непосредственно с блока усиления подаются на черно-белое ВКУ и на видеомагнитофон. Видеомагнитофон позволяет исследователям многократно анализировать при воспроизведении динамические процессы возгорания и затухания флюоресценции биообъектов и проводить наглядное сравнение опытов, выполненных в различное время.
Рис. 106. Функциональная схема высокочувствительного телевизионного микроскопа.
Для проведения интегральной оценки процессов возгорания и затухания флюоресценции биообъекта служит устройство формирования денситограмм. Величина исследуемого участка и его положение на изображении выбираются исследователем в ходе подготовки и проведения эксперимента. Время формирования денситограммы также выбирается исследователем в зависимости от скорости накопления флюоресцирующих веществ в определенных участках биообъекта, а также времени его свечения. Денситограмма выводится на экран ВКУ после окончания измерения и имеет вид ступенчатого клина, несущего по горизонтали информацию о величине сигнала, а по вертикали – о промежутке времени. Для обеспечения обработки информации с помощью ЭВМ предусмотрена возможность передачи на нее данных о денситограмме через блок сопряжения с ЭВМ.
С целью повышения контрастной чувствительности при проведении исследований малоконтрастных объектов в состав флюоресцентного телевизионного микроскопа введен блок цветового кодирования, позволяющий проводить раскрашивание черно-белых изображений в условные цвета.
Основные параметры телевизионного микроскопа: разложение – через строчное, число строк – 625, число кадров – 25, формат растра 4 :3; диапазон рабочих освещенностей в плоскости мишени трубки 10~4 лк; разрешающая способность в плоскости фотокатода передающей трубки составляет 30 лин/мм; параметры устройства регистрации денситограмм: число измерений– 256; число уровней– 16; время измерения одной денситограммы от 10 до 30 мин.
Общий вид высокочувствительной телевизионной системы для исследований микрообъектов в свете люминесценции представлен на рис. 107.
Рис. 107. Телевизионные системы для исследования микрообъектов в свете люминесценции.
На созданных образцах аппаратуры проводились оценка загрязнения проб воды различных водоемов и поиск активаторов энергетических процессов клетки при использовании в качестве биологических тест-объектов инфузории рода тетрахимена. Выполнены исследования спермы человека с целью выявления отличий нормы от патологии и поиска стимуляторов и ингибиторов ее подвижности. Проводятся работы по выявлению пригодности спермы быка к ее использованию при искусственном осеменении после консервации ее в жидком азоте, а также по выявлению оптимальных режимов консервации и определению предельных сроков хранения. Осуществлены эксперименты по выявлению на клеточном уровне механизма действия противоопухолевых антибиотиков; проводятся эксперименты по выявлению митотической активности гепатоцитов. При установке телевизионной системы на микрофлюориметр для исследования хромосом человека в несколько раз уменьшается доза облучения объекта возбуждающими лучами и тем самым уменьшается их выцветание перед фотометрированием при выборе места препарата, его фокусировке и подведении внутрь изображения фотометрической диаграммы [80].
Для офтальмологических исследований флюоресценции разработан ангиофлюориметр СО-2 (рис. 108) [30]. Телевизионный ангиофлюориметр СО-2 позволяет исследовать микроструктуры глаза в отраженном свете видимой и ближней ИК-областей спектра и в свете флюоресценции с возможностью получения количественной информации о параметрах кровотока в сосудах глаза.
Рис. 108. Ангиофлуориметр СО-2.
В состав аппаратуры СО-2 входят офтальмологическая система СО-1 с телевизионной камерой на суперкремниконе ЛИ-702, устройство формирования телевизионного сигнала, черно-белое ВКУ и анализатор телевизионного сигнала с цветным ВКУ и фотокамерой.
Широкое применение в медицине получили телевизионные ангиомикрометры, которые предназначены для качественной и количественной оценки процессов микроциркуляции живых организмов. При этом количественному анализу подвергаются такие морфометрические и гемодинамические характеристики микрососудов, как толщина стенок, внешний и внутренний диаметры, скорость кровотока и отдельных эритроцитов.
Для обеспечения качественного изображения микрососудов и точности измерения перечисленных параметров к датчикам видеосигнала предъявляются повышенные требования в отношении пространственной и временной разрешающих способностей. Однако, как правило, датчики сигнала телевизионного ангиомикрометра строятся на основе простых в стыковке с микроскопом и надежных в работе передающих трубок класса видикон, которые имеют ограниченные пространственную и временную разрешающие способности, что требует применения методов их коррекции. С этой целью может быть использован корректор пространственной и временной разрешающих способностей телевизионных систем РТ-5 [13], разработанный на передающей телевизионной трубке ЛИ-421, Корректор РТ-5 позволяет улучшить перепады яркости и увеличить контраст мелких неподвижных и движущихся микрообъектов в любом направлении. Корректор РТ-5 опробован в составе телевизионного капилляроскопа ТМ-1 (рис. 109) [17].
Рис. 109. Капилляроскоп ТМ-1
Экспериментальная проверка работы корректора РТ-5 проведена на микрососудах подчелюстной мышцы лягушки. На рис. 110, а, б приведены фотографии участка мышцы с расположенной в ней венулой диаметром ~80 мкм.. Фотографирование производилось с экрана ВКУ при включенном корректоре (рис. 110, б) и без него (рис. 110, а). Видно, что, при отключенном корректоре изображение кровотока практически полностью смазано, в то время как при его подключении можно различить даже отдельные эритроциты.
Рис. 110. Изображение венулы лягушки, полученное с помощью капилляроскопа ТМ-1. а – без корректора РТ-5; б – с корректором РТ-5.
Существенное расширение круга решаемых задач при исследовании медицинских микропрепаратов может быть достигнуто с помощью двухканальной (двухкамерной) телевизионной системы. Рассмотрим ее возможности.
1. Получение цветного изображения и классификация микрообъектов по цветовым признакам. Возможности двухканального варианта в отношении воспроизведения цвета и классификации объектов по цвету были выявлены на телевизионном микроскопе МТ-7 при анализе препаратов крови. В микроскопе цветное изображение микрообъекта проецировалось на передающие трубки камер двухканальной телевизионной системы.
Спектральная характеристика одного из каналов с помощью днхрончоского зеркала и корректирующего светофильтра смещена относительно спектральной характеристики другого. С выходов камер видеосигналы, отражающие различия входных спектральных характеристик, поступают в блоки предварительной обработки, где осуществляется компенсация неравномерности фона, стабилизация сигнала и фиксация уровня черного. Затем видеосигнал через блок микширования и коммутации поступает в блок анализа цвета и далее на цветное ВКУ. Проверка показала принципиальную возможность разделения объектов по цвету на несколько десятков классов, однако реализация требует решения ряда сложных технических задач.
2. Получение объемного изображения. Два образующих стереопару изображения микроструктуры проецируются на светочувствительные поверхности 2 трубок передающих телевизионных камер. Полученные в камерах видеосигналы от этих изображений передаются по раздельным каналам, но оба изображения воспроизводятся на одном цветном ВКУ: одно изображение– например, в красном цвете, другое – в синем. Наблюдатель снабжается очками с цветными светофильтрами (красным для одного глаза, синим – для другого), благодаря которым каждый глаз видит только одно изображение стереопары. В результате наблюдатель воспринимает объемное изображение. Можно полагать, что объемность в ряде случаев позволит облегчить анализ микроструктур.
Проверка этого принципа построения стереотелевизионной системы осуществлена на двухтрубочной установке для анализа рентгенограмм УАР-1 при наблюдении стереопар рентгенограммы белой крысы.
3. Измерение параметров движения. Существующие телевизионные методы измерения скорости кровотока с одной камерой позволяют измерять скорости до 3–4 мм/с, что в ряде случаев недостаточно. Так, метод «двух окошек» не позволяет измерять скорость выше 2 мм/с, а метод пространственной корреляции выше 4 мм/с. Двухкамерный вариант позволяет расширить диапазон измеряемых скоростей до 20 мм/с [95]. В этом случае скорость кровотока определяется методом пространственной корреляции изображений от первой и второй камеры, растры которых имеют регулируемый сдвиг фаз.
Характеристикой подвижности микрообъектов может служить видеосигнал межкадровых разностей, который связан функциональной зависимостью с их средней скоростью. В этом случае вторая камера может быть использована как устройство задержки видеосигнала на кадр с целью дальнейшего получения межкадровой разности. Если в камерах использовать вадиконы с резко отличающимися инерционностями, то можно выделить только контуры движущихся микрообъектов [43].
4. Использование второй камеры для обработки изображений. В двухканальной системе вторая телевизионная камера может использоваться для корреляции верхних пространственных временных частот. С этой целью видеосигнал, полученный в первом канале, используется для модуляции электронного пучка передающей трубки второго канала. Запись потенциального рельефа на мишени второй трубки и считывание его расфокусированным пучком осуществляются одновременно. При записи рельефа ток в нагрузочном сопротивлении трубки содержит все спектральные компоненты исходного видеосигнала. Ток, возникающий при считывании рельефа, не содержит высокочастотных компонентов спектра, поскольку рельеф создан расфокусированным пучком. Токи записи и считывания рельефа направлены навстречу, поэтому на нагрузке трубки появляется сигнал, содержащий только высокочастотные составляющие спектра, соответствующие мелким деталям изображения. Последующее суммирование этого сигнала с исходным позволяет получать изображения с подчеркнутыми контурами и увеличенным контрастом мелких деталей.
В случае передачи подвижного изображения такой корректор позволяет уменьшить инерционность системы, так как трубка второго канала выполняет функции блока задержки и первого сумматора известного корректора инерционности. Возможность коррекций инерционности проверена на телевизионном ангиомикрометре [12].
При наблюдении малоконтрастных объектов двухканальная телевизионная система позволит получать высококачественные изображения, используя известные методы спектрозонального телевидения.
5. Ввод дополнительной информации. Второй канал установки может быть использован для ввода графической информации в анализирующие блоки телевизионной системы. Для этого вторая камера устанавливается под листом прозрачного пластика, используемого в качестве планшета, и фокусируется на нем. На поверхности планшета оператор рисует необходимый контур, который телевизионной камерой преобразуется в видеосигнал, вводимый в ЭВМ или в специализированный количественный телевизионный анализатор изображений. Такое вмешательство оператора позволяет измерять геометрические параметры микроструктур на сложном фоне.
Таким образом, двухканальный телевизионный микроскоп позволит полнее удовлетворять требованиям к микроскопии в прижизненных исследованиях. По предварительным оценкам применение двухканального телевизионного микроскопа при исследованиях сердечно-сосудистой системы позволит получить высококачественное изображение и реализовать ряд методик по измерению цвета, подвижности и геометрических параметров исследуемых микроструктур.
