Автоматические устройства для подсчета частиц
Приборы предназначены для подсчета биологических частиц, взвешенных в жидкостях – эритроцитов, лейкоцитов, тромбоцитов, одноклеточных простейших, бактерий и др.
Различные модели этих аппаратов построены по единому принципу: прибор регистрирует и подсчитывает импульсы, возникающие в момент прохождения частиц через капиллярное отверстие, включенное в электрическую цепь. Частицы должны быть взвешены в растворе электролита, который является хорошим проводником электрического тока. Протекая через капиллярное отверстие, электролит не изменяет напряжения в цепи. Когда же через капиллярное отверстие проходит частица, обладающая меньшей электропроводностью, сопротивление в электрической цепи резко возрастает. Возникают импульсы напряжения, которые регистрируются и суммируются электронным счетным устройством.
Целлоскоп
Целлоскоп (рис. 72) предназначен для подсчета форменных элементов крови – эритроцитов, лейкоцитов и тромбоцитов.
Рис. 72. Целлоскоп. Передняя панель прибора (схематическое изображение). 1 – осциллоскопический экран; 2 – счетное устройство; 3 – дискриминатор; 4 – выключатель; 5 – дозатор; 6 – апертурная трубка; 7 – трубка наполнения; 8 – квадратный электрод; 9 – химический стакан с разведенной пробой крови; 10 – подвижный столик; 11 – указатель: а – белая точка, б – красная точка, в – черная точка; 12 – регулятор потока; 13 – сток; 14 – бутыль для создания вакуума; 15 – баллон.
Подсчет производится при прохождении определенного количества разведенной крови через капиллярное отверстие апертурной трубки, что осуществляется с помощью дозатора.
Различные форменные элементы крови имеют разную величину, в зависимости от которой подбирается апертурная трубка с капиллярным отверстием определенного диаметра. Минимальный размер подсчитываемых частиц устанавливается с помощью дискриминатора.
Осциллоскопический экран регистрирует частицы, проходящие через точечное отверстие апертурной трубки, в виде вертикальных линий, высота которых соответствует размерам частиц.
Устройство прибора
Дозатор (рис. 73) представляет собой U-образную трубку с тремя ампульными расширениями. В левую часть трубки сверху введен электрод в виде иглы (а). Затем трубка расширяется и за расширением расположен второй электрод, обведенный для удобства работы красным кольцом (б). Часть трубки, включающая ее колено, заполнена ртутью (в). Правая часть трубки имеет расширение, заполненное частично ртутью, а частично, поверх ртути, изотоническим раствором хлорида натрия (г), который заполняет и часть трубки за расширением и подводят к указателю (д), при помощи которого дозатор может быть связан с вакуумной бутылью и с апертурной трубкой (е).
Рис. 73. Дозатор. а — игольчатый электрод; б — красное кольцо; в — ртуть; г — изотонический раствор хлорида натрия; д — трехходовый кран (указатель); е — апертурная трубка.
При связи дозатора с вакуумной бутылью ртуть перемещается в сторону пониженного давления и заполняет ампулу правой части трубки, а в левой ее части опускается ниже красного кольца.
При соединении дозатора с апертурной трубкой ртуть в силу своей тяжести опускается, увлекая за собой определенное количество пробы разведенной крови в апертурную трубку, которая погружена в химический стакан с пробой. При этом в левой части дозатора уровень ртути повышается. Ртуть является проводником тока и колебания ее уровня замыкают и размыкают электрическую цепь, дозируя тем самым количество прошедшей через апертуру пробы крови и время подсчета форменных элементов.
Указатель направляющий работу целлоскопа (см. рис. 72, 11) является трехходовым краном, связывающим дозатор, апертурную трубку, вакуумную бутыль и трубку напол нения путем поворота указателя к точке соответствующего цвета: красная точка (б) – дозатор соединяется с вакуумной бутылью (14), белая точка (а) – дозатор соединяется апертурной трубкой.
Регулятор потока (12) связан с дозатором и регулирует прохождение пробы (поток) через апертурную трубку.
Бутыль для создания вакуума (14) наполовину заполнена водой и герметически закрыта пробкой с двумя отводами. Один из них – связывает бутыль через сток (13) с дозатором, второй – соединяет ее с резиновым баллоном (15), предназначенным для откачивания воздуха и создания в бутыли вакуума.
Подготовка прибора к работе
- Прибор должен быть заземлен, включают его в сеть с напряжением 220 В поворотом тумблера (4).
- Проверить нет ли воздуха в системе стеклянных трубок дозатор – апертура. Если воздух имеется, опускают наполнительную трубку (7) вместе с апертурной (б) в химический стакан с изотоническим раствором хлорида натрия и направляют указатель на черную точку. Если при этом воздух не выходит, следует направить указатель на красную точку, а затем снова на черную. Можно повторить это несколько раз, пока весь воздух не выйдет из трубок. Указатель оставляют на красной точке.
- Поставить дискриминатор (3) в положение, соответствующее определяемым частицам: для подсчета числа эритроцитов на 20; для подсчета числа лейкоцитов на 40.
- Проверить чистоту жидкостей, служащих для разведения крови, которые могут быть загрязнены пылью грибками и т. п., что может явиться причиной закупорки отверстия апертурной трубки.
Разведение крови для подсчета эритроцитов
Автоматические счетчики форменных элементов крови чаще всего используют для подсчета эритроцитов. Подсчет лейкоцитов можно производить только после гемолиза эритроцитов, что значительно осложняет работу.
Для подсчета эритроцитов кровь должна быть разведена в 80 000 раз. Разводящей жидкостью является изотонический раствор хлорида натрия. Разведение производят в два этапа: 1) в химическую пробирку вносят 4 мл изотонического раствора хлорида натрия 0,02 мл (пипетку Сали) крови; хорошо перемешивают; получают разведение в 200 раз; 2) в химический стакан, приданный к прибору, с помощью автоматической пипетки наливают 20 мл изото-. нического раствора хлорида натрия и вносят 0,05 мл первого разведения; получают разведение в 400 раз.
Общее разведение крови 200X400=80000 раз.
Техника работы с прибором
При включении прибора на осциллоскопическом экране появляется зеленое пятно. Пока целлоскоп нагревается, пятно превращается в тонкую линию, которая постепенно опускается и занимает постоянное положение внизу экрана. Это длится около 30 с. Целлоскоп готов к работе.
Пикоскале
Пикоскале (рис. 74) предназначен для подсчета частиц, распределенных в жидкости на единицу объема взвеси.
Рис. 74. Пикоскале. Передняя панель прибора (схематическое изображение). 1 – измерительная трубка; 2 – капиллярное отверстие; 3 – соединительная головка; 4, 5, 6 – электрод; 7 – измерительный стакан; 8 – суспензия; 9 – подвижная подставка; 10 – счетное устройство; 11 – поворотная кнопка.
Этот прибор применяется в биологии и медицине для подсчета форменных элементов крови, определения количества дрожжевых грибков, бактерий, растительных спор и т. д.
Измерительная трубка имеет капиллярное отверстие, диаметр ( которого должен соответствовать величине подсчитываемых частиц. Прибор считает только те частицы, максимальный размер которых меньше половины диаметра капиллярного отверстия. К прибору придается набор измерительных трубок с капиллярными отверстиями различного диаметра, которые подбирают к соответствующему исследованию.
Например, для подсчета эритроцитов диаметр измерительного капилляра должен быть 62 ±~3 мкм, а для подсчета более крупных лейкоцитов — 72±3 мкм.
Устройство прибора
Измерительная трубка (1) удерживается резиновым кольцом в соединительной головке (3), которая несет два электрода (4 и 5). Слева от нее расположен еще один электрод (6).
В верхней части прибора расположено счетное устройство (10), связанное с поворотной кнопкой (11).
К внутренней поверхности передней стенки прибора присоединяется механический насос, который также связан с поворотной кнопкой (11). При ее повороте с отметки 0 в измерительное положение М включается мотор, всасывающий взвесь через капиллярное отверстие (2) в измерительную трубку (/).
Между электродами (4 и 6) возникает электрический ток, напряжение которого соответствует сопротивлению электролита. При прохождении взвешенных биологических частиц через капиллярное отверстие резко возрастает сопротивление в электрической цепи, так как электропроводность их значительно ниже, чем электролита. Изменение сопротивления вызывает импульс, подающийся на электронно-механическое счетное устройство. Подсчет начинается, когда уровень взвеси в измерительной трубке достигает электрода (4).
Насос продолжает всасывать исследуемую суспензию до соприкосновения ее с электродом (5). Автоматическое устройство, ограничивающее объем жидкости в измерительной трубке, переключает насос с всасывания жидкости на давление.
Подсчет прекращается на несколько секунд. В измерительной трубке создается избыточное давление, превышающее давление жидкости в стакане. Разница давления, создаваемая по обе стороны капиллярного отверстия, заставляет жидкость вытекать из измерительной трубки. Столбик жидкости в ней опускается ниже электрода (5), и подсчет частиц начинается снова. Он прекращается, когда жидкость опустится ниже электрода (4).
Установка на 0 счетного устройства производится автоматически поворотной кнопкой (11).
Подготовка прибора к работе
- Прибор присоединяют к сети с напряжением 220 В. Он должен быть заземлен. Ставят измерительную трубку, капиллярное отверстие которой соответствует производимому исследованию.
- Установить поворотную кнопку на отметку 0.
- Включить прибор с помощью тумблера, расположенного на задней его стенке. Аппарат сразу готов к работе.
Разведение крови для подсчета эритроцитов и лейкоцитов
Разводящей жидкостью для крови является 0,9% раствор хлорида натрия (изотонический раствор). Его нужно тщательно предохранять от загрязнений, мешающих при подсчете — от пыли, бактерий, грибков. При хранении разбавителя рекомендуется применение консерванта – нейтрального формальдегида, в соотношении 0,7 мл на 1 л изотонического раствора хлорида натрия.
При взятии крови не следует пользоваться ватой для дезинфекции кожи пальца и обтирания капилляра, так как от нее остаются ворсинки, которые, попав в исследуемую пробу, могут вызвать закупорку капиллярного отверстия измерительной трубки. Целесообразно применение нежнопористой губки из искусственного материала, которую после употребления выбрасывают.
Для подсчета эритроцитов и лейкоцитов берут одну общую пробу крови: в химическую пробирку наливают
4 мл 0,9% раствора NaCl и вносят 0,02 мл (капилляр Сали) крови. Хорошо перемешивают, но не взбалтывают во избежание появления пузырьков воздуха, извращающих счет. Это основное разведение в 251 раз.
Эритроциты считают при разведении крови в 63000 раз. Второе разведение производят в измерительном стакане. В него вносят 12,5 мл изотонического раствора хлорида натрия и 0,06 мл основного разведения. Осторожно перемешивают. Результат, показанный счетным устройством, умножают на 10 000, получая количество эритроцитов в 1 мкл крови.
Для подсчета лейкоцитов кровь следует развести в 630 раз. Эритроциты при этом должны быть гемолизированы. Гемолиз производят раствором сапонина. Одновременно производят второе разведение крови. В измерительный стакан наливают 12,5 мл 0,9% раствора NaCl и Добавляют в него 3 капли 2% раствора сапонина. Туда же вливают всю основную пробу (то, что для подсчета эритроцитов из нее было взято 0,05 мл роли не играет). Тщательно, но осторожно перемешивают и оставляют на 30 с.
Заменяют измерительную трубку, применявшуюся для подсчета эритроцитов (d 60 мкм) на трубку с белой полоской (d 70 мкм). Затем производят определение.
Показания счетного устройства умножают на 100, получая количество лейкоцитов в 1 мкл крови.
Техника работы с прибором
- Измерительный стакан (7) с исследуемой суспензией (5) помещают на подвижную подставку (9) и поднимают его до погружения в жидкость измерительной трубки (1) и электрода.
- Поворотную кнопку переводят в измерительное положение М вращая ее в направлении, указанном стрелкой.
- Поворотную кнопку ставят в положение 0 1.
- Снимают показание счетного устройства.
Подсчет продолжается в среднем от 30 до 50 с. Время подсчета зависит от разности давления, создаваемого насосом, размера подсчитываемых частиц, диаметра измерительного капилляра, вязкости суспензии и ее объема.
Подсчет частиц повторяют несколько раз и берут среднее арифметическое из полученных данных.
Помехи в работе
Работа аппарата может быть обеспечена только в чистой незапыленной лаборатории. Содержащиеся в воздухе загрязнения могут попасть в исследуемый раствор и вызвать закупорку капиллярного отверстия измерительной трубки.
Если закупорка произошла во время всасывания жидкости, то подсчет замедляется или останавливается. В этом случае следует поворотную кнопку из измерительного положения М перевести на отметку 0. Всасывание жидкости прекращается, в измерительной трубке повышается давление, и закупорка может быть устранена.
Если же закупорка возникла после переключения мотора на давление, то уровень жидкости в измерительной трубке перестает понижаться. При этих условиях поворотную кнопку, стоящую в положении М, поворачивают вокруг (на 180°) и приводят в то же положение, переключая мотор на всасывание, чем устраняется закупорка. Если это не удается сразу, то манипуляцию повторяют несколько раз. После устранения закупорки подсчет начинают снова.
