Преаналитический этап при микроскопическом исследовании клеток
При использовании того или иного метода микроскопии результаты в значительной степени зависят от соответствующей подготовки объекта исследования: мазка крови, цитологического или гистологического препарата и др.
В процессе приготовления мазка крови на предметном стекле важно равномерно распределить клетки тонким слоем по всей поверхности стекла, без излишнего их повреждения с формированием «щеточной каемки», необходимой длины и толщины, т.е. получить монослойный мазок практически на всем его протяжении. Техника приготовления мазков на предметном стекле тщательно описана во многих руководствах и пособиях. Важно отметить, что не следует сильно нажимать на предметное стекло при использовании шлифованного стекла, которым будет сделан мазок, чтобы не повредить исследуемые клетки.
Значительную помощь оказывает пластиковый шпатель для растяжки мазков. Даже при большом потоке анализов применение этого шпателя позволяет стандартизовать процесс приготовления мазков, сберечь руки лаборанта и максимально соблюсти санитарно-эпидемиологические нормы. Легкий пластмассовый инструмент позволяет лаборанту равномерно распределить кровь по поверхности стекла и получить мазок высокого качества. Правый и левый края шпателя закруглены и могут быть его рабочей частью. Они имеют микропористую структуру, благодаря которой кровь хорошо смачивает поверхность шпателя и удерживается в процессе растяжки мазка. Даже в хорошо приготовленном мазке в его начале наблюдается небольшое перекрывание слоев эритроцитов, но большая площадь отделенных друг от друга клеток имеется в области «хвоста» мазка.
Существует два типа автоматических устройств для приготовления равномерных мазков крови. В их основе используется механическое распределение клеток или центрифугирование (центрифуга «Cytospin» фирмы «Shandon», Великобритания). Цитоцентрифуга концентрирует клетки на небольшой площади, и такие мазки используют для изучения клеток в низких концентрациях, например в спинномозговой жидкости.
В современных гематологических анализаторах есть устройство автоматического приготовления мазков с последующей их фиксацией и окрашиванием, что еще больше сокращает время приготовления препаратов и обеспечивает стандартизацию и постоянство характеристик окраски. Такие анализаторы требуют применения стандартных стекол размером (26 х 76 х 1 мм).
Для изучения морфологии клеток в препаратах – мазках, соскобах, пунктатах, срезах тканей – обычно первоначально проводят их химическую фиксацию с помощью коагулирующих белок веществ: тетраоксида осмия, хромовой кислоты, сулемы, уксусной или пикриновой кислот. Для более быстрой фиксации можно применять лиофилизацию – быстрое замораживание при температуре жидкого азота с последующим высушиванием в вакууме. В практике для фиксации мазков-отпечатков, соскобов используют метанол и этанол, для фиксации срезов тканей – 10 % формалин и лиофилизацию, для препаратов, исследуемых под электронным микроскопом, – глутаровый альдегид (0,5 % и 0,2 % растворы).
В целях повышения контрастности клеточных структур применяют их избирательное окрашивание, основанное на противоположности зарядов красителя и вещества структуры (например, положительно заряженные структуры оксифильны, т.е. окрашиваются кислыми красителями).
Для некоторых автоматизированных систем анализа изображения разрабатывают специальные механизированные устройства обеспечивающие стандартизацию процесса приготовления монослойных препаратов. Так, отечественная система автоматической микроскопии мазков крови «АСПЕК» выпускается в комплекте с устройством механизации и автоматизации подготовки пробы крови. Оно представляет собой градуированную стеклянную пластину, зашлифованную под определенным углом и закрепленную в специальном держателе. Плавное перемещение пластины по предметному стеклу в пазах держателя под углом 16° со скоростью 5 см/с обеспечивает стандартный клеточный монослой. Стандартизации фиксации и окрашивания мазков (по методу Паппенгейма-Крюкова) достигают путем одновременной обработки партии препаратов по 20-100 шт. также в специально разработанном для данной системы устройстве. Такая подготовка проб крови приводит к тому, что все клетки в препарате лежат отдельно друг от друга, сохраняя при этом геометрию, структуру, текстуру, оптическую плотность, цвет, яркость и т.д.
Для фиксации и окраски мазков крови можно использовать различные устройства. Приспособление ФОМК-2 (Украина) предназначено для фиксации и окраски мазков крови на предметных стеклах с минимальным расходом красителей для максимального количества предметных стекол. В состав приспособления входят узлы (модули) фиксации, окраски, промывки и сушки предметных стекол, а также съемные кассеты для размещения предметных стекол. Приспособление имеет световую сигнализацию и обеспечивает установку продолжительности окрашивания мазков (от 2 до 30 мин.). Все процедуры выполняют вручную. Одновременно окрашивают 50 предметных стекол.
Устройство «Минилаб-301» (фирма АО «ЮНИМЕД») предназначено для окраски гематологических мазков и цитологических препаратов. Оно позволяет оптимальным образом организовать рабочее место лаборанта для окраски мазков. В состав прибора входят четыре независимо работающих таймера и сушильный контейнер, через который продувается горячий воздух. Комплект принадлежностей к устройству «Минилаб-301» включает четыре штатива для предметных стекол (на 25 стекол каждый) и четыре кюветы для красителей, фиксаторов, отмывочных растворов, компактно расположенных на металлическом поддоне.
Применение этого устройства позволяет проводить одновременное окрашивание до 100 мазков; параллельно окрашивать мазки по нескольким методикам (до четырех); в несколько раз ускорить процесс высушивания окрашенных мазков.
Для приготовления препарата для исследования осадка мочи и других биологических жидкостей используют пластиковый слайд-планшет производства фирмы «PLIVA-Lachema a.s» (Чехия). Он имеет размер предметного стекла и содержит 10 камер для микроскопии, нативных или суправитально окрашенных образцов осадка мочи и других биологических жидкостей. Каждая камера покрыта тонкой, идеально прозрачной пластиковой пластинкой, играющей роль покровного стекла. Расстояние между поверхностью слайд-планшета и этим «покровным стеклом» позволяет элементам клетки располагаться однослойно.
В каждой камере (рис. 6.2) слева расположены две серии окружностей по девять в каждой серии. Они видны в проходящем свете и при малом увеличении микроскопа. При большом увеличении (объектив 40х) одна окружность занимает все поле зрения. Каждая окружность диаметром 0,376 мм, объем пространства, очерченного одной окружностью, – 0,011 мкл, девятью окружностями (т.е. каждой серии) – около 0,1 мкл. Количество клеточных элементов, подсчитанных в одной серии, соответствует количеству клеточных элементов в 1 мкл жидкости.
Рис. 6.2. Схема деталей слайд-планшета: а – вид отдельной камеры (слева две серии окружностей при увеличении в 100 раз); б – отдельная окружность в разрезе
Особенности приготовления препарата с использованием слайд- планшета определяют и особенности микроскопирования. Подсчет общего количества клеточных элементов в биологических жидкостях с использованием одной или двух серий из девяти кругов можно проводить при малом увеличении микроскопа (окуляр 10х, объектив 8х или 10х). Дифференциацию клеточных элементов (подсчет лейкоцитарной формулы, количества эритроцитов, лимфоцитов, других элементов клетки, цилиндров) ориентировочно можно проводить, используя объектив 20х, окуляр 10х, а более точную дифференциацию клеток выполняют при большом увеличении микроскопа, при объективе 40х и окуляре 10х. Таким образом можно провести микроскопическое исследование мочи по методу А. 3. Нечипоренко, исследование цитоза в спинномозговой жидкости при окраске препарата реактивом Самсона. В камере при патологии обычно содержится достаточное количество клеток, позволяющее сосчитать лейкоцитарную формулу ликвора.
Дифференциацию клеточных элементов необходимо проводить при увеличении 400 х. В тех случаях, когда клеток мало и решается вопрос о нормальном или патологическом количестве элементов клетки в ликворе, необходимо провести подсчет в камере Фукса-Розенталя. Поиск патологических клеточных элементов тканевых комплексов клеток, злокачественных новообразований и клеток арахноэндотелия, кристаллов всегда ведут при малом увеличении микроскопа.
Преимущество применения слайд-планшетов заключается в простоте приготовления препарата, сокращении затрат труда, повышение комфортности, удобстве в работе и стандартизации исследования, в первую очередь на преаналитическом этапе. При работе с ним не используют предметные и покровные стекла, а, следовательно, исключены процедуры пришлифовывания для каждого анализа покровного стекла к камере, что вызывает затруднения в работе и отнимает время. Исследование осадка мочи в слайд-планшете позволяет одновременно определить количество клеточных элементов, в 1 мл мочи (число Нечипоренко) и получить представление о количестве элементов клетки в поле зрения или препарате, провести быстрое и достаточно точное определение увеличенного количества клеток в ликворе, а также в экссудатах, транссудатах, синовиальной жидкости. Достаточно трудоемкие процессы на пробоподготовительном этапе исследования клеток могут быть автоматизированы.
