Приборы и оборудование для микроскопии
Световые микроскопы подразделяют на микроскопы плоского поля, которые обеспечивают воспроизведение объекта в двухмерном пространстве – двухмерное плоское изображение, и стереоскопические (объемное или трехмерное изображение объекта). С помощью таких микроскопов можно рассматривать прозрачные и полупрозрачные объекты.
Микроскопы проходящего света плоского поля называют в отечественной литературе биологическими микроскопами. Они позволяют рассматривать тонкие объекты исследования толщиной от 10 до 0,1 мм, просматриваемый слой от 1,0 до 0,001 мм.
В этих микроскопах возможно наблюдение объемного изображения в пределах 100-200 мкм по высоте за счет особых способов освещения (эффекты косого освещения, фазового контраста и др.).
В стереоскопических микроскопах объекты исследования имеют большие размеры – в среднем толщиной от 100 до 1 мм, просматриваемый слой по высоте (глубине) – от 50 до 0,5 мм. В этих микроскопах можно наблюдать и плоские объекты.
Микроскопы конструктивно могут быть выполнены в двух вариантах.
Прямые микроскопы имеют классическую схему построения: и в микроскопах плоского поля, и в стереоскопических наблюдательная часть (бинокулярная насадка с окулярами) расположена сверху объекта.
Инвертированные микроскопы (перевернутое строение схемы микроскопа) сконструированы таким образом, что наблюдательная часть микроскопа (бинокулярная насадка с окулярами) расположена снизу объекта. В инвертированных микроскопах оптическая система расположена ниже предметного столика, а источник света – выше. Это обеспечивает возможность свободных микроманипуляций с объектом наблюдения, что важно для работы с культурами клеток.
В зависимости от способа освещения все микроскопы подразделяют на три группы: проходящего, отраженного и падающего света. В микроскопах первого типа свет проходит через объект. Эти микроскопы позволяют наблюдать прозрачные и полупрозрачные предметы. В микроскопах отраженного света свет сначала проходит через оптическую систему микроскопа, в том числе и объектив, отражается от объекта и вновь проходит через оптическую систему (объектив). В микроскопах падающего света свет падает на объект, минуя оптическую систему (объектив), отражается от объекта и проходит через оптическую систему микроскопа (объектив). В основном микроскопы падающего света – это стереоскопические микроскопы.
В зависимости от различных принципов построения изображения выделяют микроскопы светлого поля – на светлом фоне наблюдается более темное изображение объекта. Микроскопы с методом косого освещения позволяют наблюдать контрастное изображение объекта с неровным по толщине контуром. При этом обычный прямо проходящий свет перекрывается до того, как попадает на объект. Для наблюдения объектов, имеющих размеры меньше, чем разрешающая сила микроскопа, применяют освещение под таким углом, чтобы световые лучи от осветителя не попадали в объектив. Наблюдаемые объекты становятся при этом видимыми как светящиеся точки на темном поле или контур объекта имеет ярко блестящий вид – микроскопия в темном поле, или ультрамикроскопия (микроскопы с методом темного поля).
Микроскопы с методом фазового контраста (фазово-контрастная микроскопия) позволяют с максимальной степенью визуализации и детальности наблюдать на сером фоне более темное «объемное» изображение объекта, окруженное по контуру светлой полосой; известен негативный (темнопольный) фазовый контраст, при котором наблюдается обратная картина. В этом виде микроскопии использована разная скорость распространения света в средах с разной плотностью, при этом значительно повышается контрастность структур изучаемых объектов.
Люминесцентные микроскопы обеспечивают возможность наблюдения на темном фоне свечения объектов под воздействием света. Одним из вариантов люминесцентного анализа в микроскопии является флюоресцентная микроскопия, которая основана на свойстве некоторых объектов при облучении светом с короткой длиной волны флюоресцировать на большей длине волны для выявления первичной собственной флюоресценции объекта, а также вторичной флюоресценции, вызванной окрашиванием специфическими, красящими веществами – флюорохромами.
В зависимости от характера свечения, присущего тому или иному флюорохрому, в микроскопах для исследования люминесценции или флюоресценции объектов применяют различные комбинации светофильтров для выделения необходимой длины волны света возбуждения и света излучения. По сравнению с обычными методами микроскопии люминесцентная микроскопия обладает рядом преимуществ, обеспечивая цветное свечение, высокую степень контрастности светящихся объектов, возможность исследования как прозрачных, так и непрозрачных живых объектов, различных жизненных процессов в динамике развития, обнаружения, установления локализации отдельных микробов и вирусов.
С помощью люминесцентных микроскопов проводят фенотипический анализ клеток периферической крови, костного мозга и тканей по наличию поверхностных антигенов с применением моноклональных антител в диагностике первичных и вторичных иммунодефицитов, лейкозов, а также оценку функциональной активности фагоцитирующих клеток крови. В новой технологии флюоресцентной микроскопии – FISH – препараты маркируют для «многократной» флюоресценции, чтобы выявить различные структуры объекта, которые светятся с разной длиной волны. В результате обеспечивается возможность наблюдения двух или трех маркировок в одном изображении.
Фирма ЛОМО (Санкт-Петербург) выпускает малогабаритный люминесцентный осветитель ОИ-28, который можно устанавливать в микроскопы проходящего света серий «БИОЛАМ Р.С.Д» и «МИКМЕД 1».
Наиболее известны в России модели прямой конструкции «AXIOLAB AXIOSCOP».
Для работы и исследований в области биотехнологии, генной инженерии, репродукционной медицины, в эпидемиологических вирусологических лабораториях используют инвертированные люминесцентные рабочие микроскопы. Все большее распространение получают стереоскопические люминесцентные микроскопы. В России в эксплуатации находятся несколько моделей отечественных специализированных микроскопов – ЛЮМАМ Р-8, МЛД2, ЕС ЛЮМАМ РПО-11, а также биологический микроскоп МБИ-15-2.
Отечественный микроскоп ЕС ЛЮМАМ РПО-11 отличают малые габариты, встроенная в основание вместе с коллектором и блоком питания малогабаритная галогеновая лампа, спектральный диапазон света возбуждения флюоресценции 400-550 нм, света флюоресценции 500-700 нм, объективы с увеличенными числовыми апертурами и уменьшенной собственной люминесценцией, в которых отсутствует хроматическая разность увеличения, его можно применять с фазово-контрастным устройством КФ-4М и микрофотонасадкой МФН-11.
Поляризационные микроскопы обеспечивают наблюдение на сером или темном фоне разноцветного, четкого или контрастного изображения. Обычный прямо проходящий свет с помощью полярофильтров поляризатора в осветительной системе и в промежутке между объективом и окуляром анализатора превращается в имеющий одно преимущественное направление линейно-поляризованный свет.
Поляризационная микроскопия характеризуется высокой степенью контрастности изображения в поляризованных лучах; четкостью цветного изображения без дополнительного рассеянного света, ухудшающего качество изображения; визуализацией объектов, невидимых в обычном свете и обладающих свойством анизотропии (двойного лучепреломления).
Анизотропные структуры становятся видимыми как ярко светящиеся на темном фоне. Свойство анизотропности присуще структурам с упорядоченным расположением молекул (кристаллам, Фибриллярным белкам). В медицинской практике поляризационные микроскопы применяют при анализе состава почечных и желчных камней, желчи, различных гистологических срезов (например, мышечных тканей при инфаркте миокарда, в фармакологии – при анализе лекарственных смесей).
Световые микроскопы объемного изображения объекта, или стереомикроскопы, позволяют видеть объект одновременно под своим углом зрения, как это имеет место при наблюдении невооруженным глазом.
Основная задача стереомикроскопа – не изменять физиологического восприятия объекта. Обязательным условием в конструкции этих микроскопов является наличие или двух микроскопов, или двух оптических каналов, расположенных (наклоненных) под определенным углом друг к другу, как глаза человека. Визуальная насадка при этом всегда должна быть бинокулярной.
Лазерные микроскопы позволяют сканировать объект в трех измерениях и с помощью компьютера, сопоставляя до 20 срезов в разных позициях, формировать трехмерное изображение объекта, не давая, однако, точной цветопередачи. Эти микроскопы предназначены для исследования объектов в биологии, медицине, материаловедении, криминалистике в трехмерном изображении на уровне разрешения, приближенного к электронной микроскопии с помощью лазерной системы, состоящей из 3-4 лазеров и комплексной системы светофильтров.
В электронных микроскопах роль линз выполняют электрические и магнитные поля, обладающие вращательной симметрией. Пучок электронов, движущихся в вакууме с постоянной скоростью, при ускорении их электрическим полем создает волновой процесс с определенной длиной волны. Проходя через изучаемый объект, электроны не поглощаются им, а рассеиваются, поэтому, чем больше объект рассеивает электроны, тем более темным он представляется на флюоресцирующем экране микроскопа.
Применение специфических цитохимических красителей, в частности солей металлов, позволяет значительно расширить исследовательские возможности электронной микроскопии применительно к выявлению на субмикроскопическом уровне локализации отдельных веществ – ферментов, нуклеиновых кислот и др. Современные просвечивающие электронные микроскопы обладают компьютерным управлением, обеспечивающим мощную систему обработки изображения. Они могут быть использованы практически в любой области биологии, патологической анатомии, гистологии, материаловедении.
