Принцип действия и устройство микроскопа
Потребность в визуальных наблюдениях работников лабораторий за клетками, их структурами или другими корпускулярными компонентами биоматериалов пациентов возникает в следующих случаях: при исследовании мочи, спинномозговой и других биологических жидкостей; подсчете клеток крови в счетных камерах- дифференциальном подсчете лейкоцитов в мазках периферической крови; исследовании клеток в мазках, соскобах, срезах тканей; исследовании микроорганизмов, грибов, паразитарных организмов.
Для этого используют оптические приборы – микроскопы. Микроскоп (от греч. Mikros – малый, skopeo – смотрю) – это прибор, позволяющий получать увеличенное изображение объектов и структур, недоступных глазу человека. В медицинских и биологических исследованиях применяют методы световой и электронной микроскопии. Современные микроскопы – это новое поколение приборов со сложной оптико-механической и электронной конструкцией.
Принцип световой микроскопии основан на законах геометрической оптики и волновой теории образования изображения. Для освещения используют естественный свет или искусственные источники света. Световые микроскопы могут увеличивать объект размером от 0,5 мкм с разрешением элементов объекта до 0,1 мкм более чем в 1 800 раз.
Электронная микроскопия обеспечивает получение электроннооптического изображения с помощью потока электронов. Построение изображения тоже основано на законах геометрической и волновой оптики, а также на законах электромагнитных полей. Электронная микроскопия делает возможным исследование объектов, размеры которых лежат за пределами разрешающей способности светового микроскопа (менее 0,2 мкм) и применяется для изучения вирусов, бактериофагов, тонкого строения микроорганизмов и других субмикроскопических объектов и макромолекулярных структур. Она обеспечивает увеличение объекта в 20 000 раз.
Современные микроскопические приборы подразделяют на следующие группы: биологические микроскопы (проходящего света), инвертированные биологические микроскопы (инвертированные
микроскопы проходящего света), люминесцентные микроскопы; поляризационные микроскопы проходящего света; стереоскопические микроскопы; анализаторы изображения. По степени сложности каждую группу микроскопов можно разделить: на учебные; путинные; рабочие; лабораторные; исследовательские.
Микроскоп состоит из нескольких функциональных частей: механической, оптической и осветительной системы (рис. 6.1).
Рис. 6.1. Схема устройства микроскопа: 1 – окуляр; 2 – штатив; 3 – грубая настройка; 4 – тонкая настройка; 5 – основание; 6 – зеркало; 7 – конденсор под предметным столиком с ирисовой диафрагмой; 8 – предметный столик; 9 – объектив; 10 – револьверная головка; 11 – призма; 12 – основной тубус
Механическая часть микроскопа представлена основным блоком – штативом, в состав которого входят основание и тубусо-держатель. Предметный столик микроскопа, на котором располагают, крепят и фиксируют в определенном положении объект наблюдения, является чисто механическим узлом микроскопа. Он закреплен на специальном кронштейне. Предметные столики могут быть подвижными и неподвижными. Неподвижные столики обычно применяют в самых простейших моделях микроскопов, передвижение объекта на них наблюдатель выполняет вручную. В настоящее время такие микроскопы встречаются очень редко. При оснащении микроскопов подвижными столиками возможно механическое перемещение и вращение объекта под объективом микроскопа. Управляемые от электродвигателя предметные столики называют сканирующими, в современных микроскопах управление может происходить с помощью специальной компьютерной программы.
Механические компоненты микроскопа выполняют не только функцию крепления и обеспечения необходимого взаиморасположения оптических и осветительных компонентов, но и их точного перемещения в процессе фокусирования и наводки на резкость, создания оптимальных условий освещения, передвижения и ориентации исследуемого объекта.
Оптическая часть микроскопа обеспечивает его основную функцию, создает увеличенное изображение объекта с достаточной степенью достоверности по форме, соотношению размеров и цвету.
Оптика микроскопа должна обеспечивать такое увеличение и разрешение элементов, которые позволяют проводить наблюдение, анализ и измерение, соответствующие требованиям методик в практике клинико-диагностических лабораторий.
Основными оптическими элементами микроскопа являются объектив, окуляр, конденсор; вспомогательными – осветительная система, оптовар, визуальные и фото насадки с оптическим адаптерами и проективами.
Принципиальная схема оптической части микроскопа состоит из двух систем линз. Одна из них расположена в окуляре, т.е. устройстве для глаз наблюдателя. Окуляр вставлен в тубус – трубку по которой свет от наблюдаемого объекта проходит к глазу наблюдателя. Вторая система линз находится в непосредственной близости к изучаемому объекту, поэтому называется объективом. Различными конструкциями микроскопов предусмотрено наличие одного, двух или трех окуляров (монокулярные, бинокулярные, тринокулярные микроскопы), нескольких сменных объективов, позволяющих подбирать желательные степени увеличения объекта. Бинокулярные микроскопы удобнее для наблюдателя, поскольку в этом случае есть возможность наблюдать объект двумя глазами одновременно.
Объектив микроскопа выполняет функцию воспроизведения изображения наблюдаемого объекта с требуемым увеличением при разрешении элементов изображения, необходимом для их детального изучения, и при точном воспроизведении их по форме и цвету. Объективы имеют сложную конструкцию, которая включает несколько одиночных и склеенных компонентов из двух, трех, а иногда до 13-14 линз.
Маркировка объективов осуществляется в соответствии с системой надписей на их корпусе, принятой Международной организацией по стандартизации (ISO). Большое значение имеет наличие иммерсионной среды между объектом и объективом, толщина покровного стекла. В некоторых технологиях микроскопирования существует также необходимость выполнения работ непосредственно под микроскопом. В них очень важна такая характеристика, как рабочее (свободное) расстояние между объективом и объектом. Такие объективы называют объективами с большим рабочим расстоянием.
Основные формулы, используемые в микроскопии, позволяющие рассчитать общее полезное увеличение, увеличение объектива, окуляра, поле на предмете, числовую апертуру и разрешающую способность микроскопа, а также детальные сведения оо оптических схемах и устройстве различных типов микроскопов приведены в специальном справочнике.
При работе с иммерсией применяют три типа иммерсионных жидкостей: масляную (МИ/Oil), водную (ВИ/W) и глицериновую (ГИ/Glyc). Последнюю в основном применяют в ультрафиолетовой микроскопии. Иммерсионная жидкость необходима для повышения разрешающей способности микроскопа; в соответствии с технологией микроскопирования; повышения видимости за счет увеличения разности показателя преломления среды и объекта; увеличения глубины просматриваемого слоя, который зависит от показателя преломления среды. Иммерсионная жидкость может уменьшать количество рассеянного света за счет устранения бликов от объекта. При этом исключаются неизбежные потери света при попадании его в объектив.
Окуляр – обращенная к глазу часть оптического прибора, предназначенная для рассматривания с некоторым увеличением изображения, созданного объективом прибора. Окуляры служат для построения микроскопического изображения на сетчатке глаза наблюдателя. Они играют роль лупы, дополнительно увеличивающей изображение, созданное объективом. Окуляры в общем виде состоят из двух групп линз: глазной, ближайшей к глазу наблюдателя, и полевой, ближайшей к плоскости изображения, в которой объектив строит изображение рассматриваемого объекта.
Одним из направлений в современном производстве микроскопов является использование в них оптики без хроматической разности увеличения (ХРУ = 0 %). Этот принцип связан с развитием систем анализа изображения, в которых от собственно изображения требуется четкость контура для его распознавания и затем обработки с помощью компьютерных программ (измерение площади, периметра, оптической плотности и др.).
Окуляры обеспечивают работу оператора, имеющего нормальное зрение или пользующегося очками. Если микроскопические исследования требуют проведения точных измерений, то конструкция окуляров таких микроскопов предусматривает расположение внутри них шкал и сеток. Эти окуляры изготавливают с минимальным искажением изображения на краях поля зрения.
Осветительная система – это система линз, диафрагм и зеркал (при необходимости), обеспечивающая равномерное освещение объекта и полное заполнение апертуры объектива. В нее входят: источник света (естественный или искусственный); коллектор — оптическая система, проецирующая нить лампы в плоскость апертурной диафрагмы конденсора, при этом нить лампы увеличивается до размера диафрагмы. При встроенной осветительной системе проходящего света коллекторная часть расположена вблизи источника света в основании микроскопа и предназначена для увеличения размера светящегося тела. Для обеспечения настройки коллектор может быть выполнен подвижным и перемещаться вдоль оптической оси. Вблизи коллектора располагается полевая диафрагма микроскопа.
Конденсор – оптическая система, которая проецирует диафрагму коллектора в плоскость предмета, обеспечивая требуемую числовую апертуру осветительного пучка, она предназначена для увеличения количества света, поступающего в микроскоп. В микроскопах проходящего света конденсор расположен между объектом (предметным столиком) и источником света (коллектор, зеркало). В микроскопах отраженного света роль конденсора выполняет объектив.
В качестве источника света в осветительной системе используется естественный свет, а также искусственное освещение, создаваемое лампами накаливания, галогенной, ртутной лампами.
С формой и размером нити лампы связаны габаритные размеры и увеличение осветительной системы. Мощность, габаритные размеры источника света влияют на параметры и габаритные размеры блока питания лампы, и все это влияет на размеры и дизайн самого микроскопа.
Для получения достаточно яркого и равномерно освещенного поля зрения микроскопа осветительная система и источник света должны обеспечивать следующие электрические параметры: световой поток в плоскости предмета и световой поток, попадающий на сетчатку глаза или фотопленку; освещенность; максимальную силу света; яркость изображения; спектральную составляющую (те линии спектра, которые выделяет данный источник света). В отечественных световых микроскопах для обеспечения этих параметров использовали лампу накаливания РН8-20-1, а в современных микроскопах отечественного и зарубежного производства применяют в основном галогеновые лампы, чаще всего фирмы «OSRAM» (Германия), с напряжением 6 В, мощностью 20 или 30 Вт. В исследовательских микроскопах применяют более мощные лампы — напряжением 12 В и мощностью 50 или 100 Вт.
