Определение глюцидных веществ

Для отделения глюцидов, присутствующих в том или ином биолога, ческом препарате весьма трудно разработать какую-либо общую схему Основной причиной этого положения является отсутствие каких-либо методов, допускающих либо полную экстракцию глюцидов, либо экстракцию определенной группы этих веществ (полиозиды, глюцидо-липиды глюцидо-белки, простые глюциды).

Что касается идентификации глюцидных компонентов, экстрагируемых из какого-либо биологического препарата, несмотря на то, что этот вопрос нельзя считать полностью разрешенным, однако, ныне существуют в этом направлении значительные возможности, главным образом, с тех пор, как хроматографический метод дополнил классические цветные дифференциальные реакции.

Экстрагирование полиозидов

Полиозиды экстрагируют различными способами, в зависимости от того, необходимо ли отделить свободные полиозиды или полиозиды, связанные в виде соединений с липидами и белками.

Полисахариды – вещества особо часто используемые в бактериальной клетке, можно извлечь либо растворителями, либо умеренным гидролизом. Целью всех этих методов является разрушение и удаление белков из изучаемого препарата.

Что касается экстракционных методов с применением растворителей, эти методы можно сгруппировать в две категории: (а) методы, применяющие растворители белков (фенол),  причем полисахарид остается нерастворимым; (б) методы, при которых полисахарид остается в растворе, причем осаждаются белки (трихлоруксусная кислота, фосфорновольфрамовая кислота и остальные осадители). В основном, для бактериальных сахаридов отдается предпочтение второй категории методов: осаждение белков трихлоруксусной кислотой 5% без нагревания, диализ надосадочной жидкости для удаления кислоты и малых молекул и осаждение полисахаридов из диализата обработкой спиртом-ацетоном.

Независимо от типа применяемого растворителя (нейтральная, щелочная или подкисленная вода, формамид, таурохолат натрия, диэтиленгликол и др.), вместе с полисахаридом увлекается ряд белковых соединений, а также фосфолипиды. Рекомендуется удалять эти последние до извлечения полисахаридов (экстракцией органическими кислотами в холодном состоянии), в случаях, если препарат содержит значительное количество липидов (случай туберкулезной палочки).

Трипсиновая дигестия препарата, предшествующая экстрагированию полисахарида, также является эффективным методом разрушения присутствующих в препарате белков, способствуя таким образом отделению полисахаридов. Дигестию можно осуществить инкубируя препарат в течение 48–72 часов при 37°С под хлороформом, в хорошо закупоренной колбе, в присутствии 1–5% раствора трипсина в буферном фосфатном растворе 0,2 м с pH 7,5.

Умеренный кислый гидролиз препарата также дает возможность довольно легко отделить полисахариды, поскольку эти последние являются более устойчивыми на воздействие слабых кислот, чем белковые макромолекулы. Для экстрагирования полисахаридов стафилококка (Жулианелль и Вайнгард) и стрептококка (Лансфильд) используют НС1 н/16 и, соответственно НС1 н/20. Однако в основном применение сильных кислот следует избегать, так как эти последние – даже в значительных разбавлениях – могут гидролизовать полисахариды как таковые. По этим причинам следует предпочесть гидролиз посредством разбавленных растворов уксусной кислоты.

Щелочный гидролиз не рекомендуется, поскольку он вызывает расщепление ацетиловых групп, довольно часто присутствующих в полисахаридах (Авери и Гебель).

На практике, если мы имеем дело с биологическим препаратом, нуждающимся в экстракции полисахаридов, следует учесть, что в настоящее время для этого пока еще не существует единой разработанной методики. Прибегают к целому ряду попыток, испытывая по очереди различные вышеприведенные принципиальные методы, при возможном их сочетании, в конечном итоге прибегая к наиболее подходящему варианту.

Глюкопротеиды, в зависимости от типа содержимого полиозида (кислого или нейтрального), подврегаются экстракции отдельными методами.

Кислые глюкопротеиды (хондроитинсерная и гиалуроновая кислоты) отделяются легко, причем применение гидролиза не является необходимым. Первая водная экстракция предварительно обезвоженного препарата достаточна для получения довольно значительного количества глюкопротеида.

Поскольку нейтральные глюпротеиды (из яйца, серомукоиды, бактериальные и др.) содержат полиозиды, тесно связанные с протеидами, они нуждаются в предварительном гидролизе, обеспечивающем разрыв связей. Этот гидролиз можно осуществить применяя либо уксусную кислоту (соматический антиген грамотрицательных бактерий), либо барит (сывороточные соединения, яичные глюкопротеиды). Вместо гидролиза, распада полиозида можно достигнуть добавляя фенол (0,1–1 %), с последующим диализом препарата. Эти операции разрушают присутствующий в соединении белок и делают его нерастворимым.

Глюцидо-липиды. В настоящее время методы экстракции этих соединений весьма ограничены. Более распространенный способ применяется Андерсоном, для получения полиозида из фосфатной фракции туберкулезной палочки.

По этому методу к 10% раствору фосфатидов в бензоле добавляют 10 дщ спиртвого раствора КОН 15%, оставляют при комнатной температуре. На следующий день смесь центрифугируют, а осадок сохраняют.

Надосадочную жидкость снова оставляют при комнатной температуре, а на следующий день образовавшийся осадок центрифугируют и смешивают с первым центрифугатом. Затем эти осадки промывают бензолом и эфиром и высушивают в вакууме. Получаемый порошок (примерно 60% веса фосфатида) растворяют в 100 мл дистиллированной воды, получая мутный, сильно щелочный раствор. При подкислении уксусной кислотой образуется тонкий осадок, который фильтруют и промывают. Фильтрат и промывочные воды концентрируют в вакууме до сиропообразной консистенции. Этот препарат обезвоживают абсолютным спиртом. Полученный порошок (40% веса фосфатида) представляет собой неочищенный полиозид, извлеченный из исходного глюцидо-липидного соединения.

Очищение полиозидных экстрактов

Также как и в случае метода экстракции этих препаратов, единой схемы очищения экстрагированных полиозидов не существует. Необходимо, чтобы для каждого полученного препарата исследователь разработал наиболее эффективную схему очистки. Однако, существуют общие закономерности, лежащие в основе разнообразных способов очистки.

Из полученного глюцидного экстракта полиозид может быть очищен следующими способами:

• фракционированием и повторным осаждением спиртом (наиболее часто), ацетоном, уксусными смесями ацетона и спирта и др.;
• осаждением спиртом, повторным растворением осадка и удалением протеидов из этого последнего раствора посредством добавления осадителей (например, трихлоруксусная кислота);
• осаждением глюцидного экстракта (удаление протеидов) и осаждением полиозида в надосадочной жидкости;
• сочетанием методов (а) и (б).

В заключение, препарат может быть подвергнут диализу, обеспечивающему удаление малых молекул. Таким образом, полученный раствор полиозидов обрабатывают спиртом (3–5 объемов) обеспечивающим осаждение полиозида. Осадок промывают спиртом, ацетоном и эфиром, превращая его в порошок, путем высушивания в вакууме.

Если полиозидный препарат был заражен нуклеиновыми кислотами, эти вещества можно удалить электродиализом, осаждением свинцовыми или бариевыми солями или ультрацентрифугированием.

Экстрагирование простых глюцидов

Наиболее простым методом экстракции этих веществ является обработка при нагревании анализируемого препарата достаточным объемом воды. Однако этот метод отличается тем недостатком, что при нем в раствор могут перейти не только простые глюциды, но и многочисленные неглюцидные восстановительные вещества, а также полиозиды.

С этой точки зрения высококачественным методом является обработка в холодном состоянии анализируемого препарата 96° спиртом и разбавление таким образом полученной взвеси до получения 66% спиртной концентрации. Экстракцию продолжают в течение 24 часов в холодильнике, после чего твердые частицы удаляют центрифугированием, причем экстракцию 66% спиртом повторяют 2–3 раза.

Экстракционные жидкости высушивают в вакууме, а полученный сухой продукт снова берут с водой. Этот способ обладает тем преимуществом, что он способствует удалению полиозидов (осаждаемых спиртом) и ограничивает количество увлекаемых в экстракт примесей.

Техника спиртовой экстракции может быть применена с наибольшим эффектом в случае препаратов, предварительно подвергнутых легкому кислому гидролизу (уксусная кислота 0,2 н). Обычно гидролиз производят в течение 2 часов при 100°С с орошением. Перед спиртовой экстракцией гидролизат нейтрализуют. Техника экстракции после гидролиза отличается преимуществом отделения всех простых озов, весьма часто удерживаемых макромолекулярными соединениями. Напротив, умеренный гидролиз не разрушает полизахаридов, а последующая спиртовая экстракция исключает возможность их увлечения в раствор.

Очищение глюцидных экстрактов

Независимо от метода, применяемого для экстракции простых озов, в полученном растворе всегда присутствует ряд неглюцидных соединений, наиболее часто белкового происхождения. Поэтому для их очистки глюцидные экстракты необходимо подвергать осаждению.

Штауб делит осадители растворов простых глюцидов на четыре категории: (а) металлические гидраты; (б) соли тяжелых металлов; (в) кислоты и (г) адсорбенты.

Среди металлических гидратов, наиболее часто применяемым является гидрат цинка, предложенный Гагедорном и Йенсеном для классического метода определения глюцидов в крови.

Основной ацетат свинца также используется в качестве осадите ля, в 33% растворе. Однако среди солей тяжелых металлов наиболее часто применяемым осадителем является ртутный (HgN03 40%; к раствору добавляют достаточное количество HN03, допускающее растворение нитрата ртути). Соли тяжелых металлов и главным образом ртутные соли, однако осаждают гексозамины, вследствие чего их применение является ограниченным.

Трихлоруксусная кислота в конечной 5% концентрации (приблизительно 0,5 н) является наиболее эффективным осадителем белков для очистки глюцидных экстрактов. Однако, некоторые авторы предпочитают в связи со сходящимися результатами – применение фосфорномолибденовой и фосфорновольфрамофой кислоты.

Среди адсорбентов, обеспечивающих удаление не только протеидов но и других веществ (как например красящие вещества), наиболее часто применяемыми являются: ионообменные смолы, животная сажа и картофельный крахмал. В случае применения этих веществ, необходимы известные меры предосторожности, во избежании одновременной адсорбции известных количеств глюцидов. Так, например, животную сажу (норит) предварительно тщательно промывают для удаления возможных примесей и следов кислоты. Картофельный крахмал также необходимо предварительно промыть несколько раз дистиллированной водой и затем высушить.

Идентификация глюцидов

Также как и в случае липидных веществ для характеристики того или иного полиозида весьма важным является уточнение содержания азота и фосфора (в пересчете на 1 г сухого продукта). Довольно часто однако, эти значения дают указания относительно степени загрязнения препарата.

Для характеристики полисахаридов, благодаря тому, что эти вещества участвуют в антигенной структуре организма, из которого они происходят, применяют идентификацию и гаптеновых свойств с помощью реакции осаждения или гемагглютинирования в присутствии гомологичных иммунных сывороток.

Однако с химической точки зрения содержание восстановительных веществ и идентификация их природы является обычным критерием, применяемым для охарактеризования полиозидов. С этой целью препарат необходимо подвергнуть гидролизу, осуществляющему отделение простых компонентных глюцидов. Весьма эффективный гидролиз достигается растворением препарата в НС1 н. и нагреванием раствора в течение 8 часов с орошением в водяной бане при 100° С. После гидролиза на точно отмеренной фракции препарата восстановительные сахары определяются методом Хагедорн – Иенсена или, еще лучше, колориметрическим методом с антроном причем результаты условно выражаются в мг глюкозы на 1 г препарата. На другой фракции гидролизата идентифицируют простые компонентные глюциды, применяя для этой цели количественный хроматографический метод.

Однако идентификацию и определение глюцидных компонентов в очищенном экстракте (полиозидном гидролизате или растворе простых глюцидов) можно осуществить также применяя обычные химические методы. Наиболее рекомендуемым способом является сопоставление получаемых хроматографическим путем данных с химическими данными.

Пентозы можно идентифицировать и определять с помощью реактива Биал (бензидин 4% в ледяной уксусной кислоте). В присутствии этого реактива при нагревании пентозы дают устойчивый красный цвет.

Метилпентозы, как например, рамноза и фукоза не дают такой реакции. Глюкоза, фруктоза, галактоза и прочие гексозы не реагируют или дают желтовато-коричневую окраску.

Для определения пентозов применяют способ Дише и Шварца: 1 мл анализируемого раствора (который должен содержать 0,01–0,02 мг пентозов) приводят в контакт с 5 мл РеС13 0,05% в концентрированной соляной кислоте и с 0,5 мл спиртного раствора арцинола 10%. Смесь оставляют на 3 минуты в водяной бане при 80°С, охлаждают на льду и затем производят отсчет на фотометре с фильтром S43. Полученные значения пересчитывают в мл пентозы путем экстраполирования на специально построенной калибровочной кривой в данных экспериментальных условиях.

Метилпентозы дают при нагревании характерную фиолетовую реацию с реактивом Розенталера (ацетон 20% в концентрированной соляной кислоте) и желтую окраску при нагревании с концентрированной соляной кислотой, причем к ним добавлфют смесь из равных частей анилина и уксусной кислоты (реакция Шиффа). В этих условиях простые пентозы дают красный цвет.

Для определения метилпентоз применяют метод Дише-Шетлса с цистеином и серной кислотой: к 1 мл анализируемого раствора (содержащего не менее 0,05 мг метилпентозы) добавляют 4,5 мл H2S04 разбавленной водой 6/1. Смешивают, нагревают в течение 5 минут до 20–22°С и затем еще 3–10 минут в кипящей водяной бане. Охлаждают и добавляют 10 мл раствора солянокислого цистеина 3%. Получаемая зеленая окраска подвергается фотоколориметрированию, причем получаемое значение преобразуют с помощью калибровочной кривой в мг метилпентозы.

Рибозу определяют, применяя реактив Мешбаума. Реактив приготовляют непосредственно перед употреблением, растворяя 0,2 г орцинола, (перекристаллизованного в бензоле) в 20 мл концентрированной НС1 (уд. вес == 1,18), содержащей 0,1% FeCl36H20. С помощью этого реактива удваивают объем анализируемого раствора, причем смесь нагревают в течение 10 минут в водяной бане при 100°С.

Охлаждение. Получаемый зелено-синий цвет экстрагируют в 3 приема с помощью 2 мл и 1,5 мл амилового спирта для анализа. К общему количеству амилового спирта добавляют 1 мл этанола, при этом объем доводят до 8 мл этиловым спиртом. Яркость окраски отсчитывают на фотометре, а полученные значения превращают в мг посредством экстраполирования на калибровочной кривой.

Дезоксирибозу определяют с помощью реактива Дише: 1 г дифениламина (перекристаллизованного в метаноле), растворенного в 98 мл ледяной уксусной кислоты и 2 мл концентрированной серной кислоты. Из анализируемого раствора берут 3 мл, добавляют 6 мл реактива и нагревают в течение 10 минут в водяной бане при 100°С.

После охлаждения яркость окраски отсчитывают на фотометре (красный фильтр) причем превращение в мг производят с помощью калибровочной кривой.

Гексозы можно определять спектрофотометрически, с помощью метода с цистеином и серной кислотой (описанного для метилпентозы при условии, чтобы отсчет абсорбции проводился в пределах от 3 800 до 4300. В этих условиях глюкоза, фруктоза, галактоза, моноза и сорб03а дают желтую окраску с максимальной абсорбцией между 4 100 и 4 150 Д. Кетогексозы дают интенсивные синие окраски при нагревании в присутствии дифениламина (0,1 г дифениламина, растворенного в 0,9 мл концентрированной уксусной кислоты и 10 мл концентрированной соляной кислоты). Аналогичную окраску дают также алдогексозы, но в данном случае появление окраски запаздывает. Аналогичным образом кетогексозы дают значительно более яркий пурпурный цвет, чем алдогексозы, если они находятся при нагревании в контакте с резорциновым реактивом (7 частей НС1 30% и 1 часть ледяной уксусной кислоты, содержащей 0,1% резорцинола и 0,25% тиомочевины). Эти реакции дают возможность дифференцировать алдогексозы от кетогексоз, если наблюдают за идентификацией во времени цветной реакции.

Гексозамины определяют колориметрически посредством реакции, описанной Эльсоном и Морганом. К 4 мл анализируемого раствора (содержащего не менее 0,025 мг глюкозамина) добавляют 2 мл раствора ацетил-ацетона (2% в Na2C03 0,5 н.), приготовленного непосредственно перед употреблением. Смесь берут в герметически закупориваемую бутылку, затем нагревают в течение 20 минут при 100°С. После охлаждения добавляют 4 мл спирта 96° и 2 мл реактива Эрлиха (0,8 гп-диметиламинобензальдегида в 30 мл спирта и 30 мл НС1 (уд. вес = 1,8). По истечении 45 минут яркость получаемой окраски отсчитывают на фотометре.

Ацетилгексозамины могут определяться аналогичным способом как и гексозамины, лишь с тем различием – впрочем, представляющим собой средство дифференцирования – что отпадает необходимость в предварительной обработке продукта ацетил-ацетоном, так как ацетиловые группы присутствуют в молекуле.

Уроновые кислоты дают характерные реакции (красный цвет) при нагревании с раствором нафторезорцинола 0,2% в сильно кислой среде (реакция Толленса). Эту реакцию применяют также для определения уроновых кислот.

2 мл анализируемого раствора смешивают с 2 мл водного раствора резорцинола 0,2% и с 2 мл концентрированной НС1. После 30-минутного нагревания в водяной бане при 100°С, быстро охлаждают на льду. Добавляют 2 мл спирта и 15 мл эфира (эфир предварительно промывают FeS04 1%, затем водой и, наконец, сушат с несколькими кристаллами Na2SC>4). Сосуд закупоривают стеклянной притертой пробкой, взбалтывают механически в течение 20–30 минут и оставляют для отделения эфира, растворившего образовавшуюся окраску. Яркость этой последней отсчитывают на фотометре.

Дигидроксиацетон можно идентифицировать и определять благодаря свойству этого триоза восстанавливать при нагревании молибденовый реактив (в 400 мл NaOH 5% растворяют при нагревании 35 г молибденовой кислоты и 5 г вольфрамата натрия; после охлаждения добавляют 125 мл концентрированной Н8Р04 и разбавляют до 500 мл).

В течение 15 минут нагревают 2 мл определяемого раствора в водяной бане при 100°С и в присутствии 2 мл молибденового реактива, затем титруют до обесцвечивания. Каждые 1,14 мл перманганата, израсходованных для титрования соответствуют 0,2 мг дигидроксиацетона.

Гексозофосфаты. В настоящее время известно довольно большое число гексозофосфатов, среди которых наиболее важными являются: гексозо-1-фосфат (сложный эфир Кори), гексозо-6-фосфат (сложный эфир Робинзона) и гексозо-1,6-дифосфат (сложный эфир Гарден^Юнга). Среди этих эфиров восстанавливающими свойствами обладают лишь только дифосфорный эфир и гексозо-6-фосфат, обладающий, однако, меньшей восстановительной способностью по сравнению с гексозами в свободном состоянии. Слодовательно, их можно определять с помощью метода Хагедорн-Иенсена, или, еще лучше, колориметрическим способом с антроном. Гексозофосфаты также можно дозировать определяя соержимый ими фосфор (органический Р) или выделяемый при гидролизе (минеральный Р).

В растворе, содержащим смесь, состоящую из трех упомянутых гексозофосфатов, определение каждого из них в отдельности представляется возможным благодаря тому, что дифосфорный эфир осаждается при нагреве в контакте с гидратом бария, а гексозо-1-фосфат гидролизуется гораздо быстрее при нагреве до 100°С в кислой среде, чем гексозо-6-фосфат. Для этого необходимы следующие операции:

• из гексозофосфатного раствора минеральный фосфор удаляют с помощью фосфорно-вольфрамового реактива. Надосадочную жидкость нейтрализуют и добавляют в избытке ацетат бария, который затем нейтрализуют. Операцию производят при нагревании. Образовавшийся осадок содержит все количество гексозо-1,6-диофосфата. Этот центрифугат собирают и несколько раз промывают горячей водой;
• надосадочную жидкость и промывочные воды соединяют вместе и добавляют спирт до 50% концентрации. Образовавшийся осадок, содержащий однофосфорные эфиры берут с НС1 н. и гидролизуют с орошением в течение 10 минут в водяной бане при 100°С. В этих условиях фосфорная кислота полностью отделяется (ее можно определять в виде минерального Р) из глюкозо-1-фосфата в то время как глюкозо-6-фосфорный эфир освобождает менее 5% содержимого фосфора.

С полученными таким образом препаратами можно производить следующие определения:

1. Определение общего количества органического Р в исходном растворе после удаления минерального Р (возьмем а – полученное значение).
2. Определение Р присутствующего в осадке, образовавшемся после обработки ацетатом бария (возьмем б – полученное значение).
3. Определение минерального Р в конечном кислом гидролизате (возьмем в – полученное значение).

С помощью этих определений можно рассчитать количество каждого гексозофосфата, присутствовавшего в исходном растворе.

Таким образом: б – эквивалент в Р дифосфорного эфира; а–б щ общее количество однофосфорных эфиров; в – эквивалент в Р глюкозо-1-фосфорного эфира, а а–(б + в) – эквивалент в Р глюкозо-6-фосфата присутствующего в анализируемом растворе.