Определение холестерина в крови

Для определения холестерина в крови по методу Блюра необходимо следующее оснащение рабочего места:

1. Штативы.
2. Широкие пробирки.
3. Мерные центрифужные пробирки.
4. Микропипетки.
5. Градуированные пипетки на 2-5 мл.
6. Капельницы.
7. Стекляные палочки.
8. Воронки.
9. Бюретки.
10. Водяная баня.
11. Колориметр Дюбоска или КОЛ-1.
12. Фильтровальная бумага.
13. Спирт этиловый 96°.
14. Эфир.
15. Холестерин.
16. Хлороформ.
17. Уксусный ангидрид.
18. Концентрированная серная кислота удельного веса 1,84.

Для определения холестерина в крови по методу Мрскоса и Товарека необходимо следующее оснащение рабочего места:

1. Штативы.
2. Мерные и простые центрифужные пробирки.
3. Градуированные пипетки на 1, 2 и 5 мл.
4. Лед.
5. Фотоэлектроколориметр.
6. Сульфосалициловая кислота.
7. Ледяная уксусная кислота.
8. Уксусный ангидрид.
9. Концентрированная серная кислота.

Определение холестерина в крови по методу Блюра

В основу метода положено свойство безводного холестерина в растворе хлороформа давать с уксусным ангидридом и серной кислотой красное окрашивание, переходя еще затем в синие и зеленые тона. О количестве холестерина судят по интенсивности окраски, определяемой колориметрическим способом.

Для этого метода необходимы следующие реактивы:

1. Реактив Блюра. Готовят смешением 1 части эфира с 3 частями 96° этилового спирта.
2. Стандартный раствор холестерина: 100 мг сухого, белого цвета холестерина взвешивают в бюксе на аналитических весах, после чего, ополаскивая бюкс хлороформом, навеску холестерина количественно переносят в сухую мерную колбу на 100 мл. Постепенно добавляя хлороформ, полностью растворяют холестерин и доводят количество раствора до метки. В связи с тем что хлороформ летуч, посуду, в которой хранится стандартный раствор холестерина, плотно закрывают пробкой и парафинируют. В 1 мл приготовленного стандартного раствора содержится 1 мг холестерина.
3. Рабочий раствор холестерина. Готовят из стандартного, разводя его в 10 раз, в день постановки исследования (в мерную колбочку на 25 мл наливают 2,5 мл стандартного раствора холестерина и доводят хлороформом до метки).
4. Хлороформ.
5. Уксусный ангидрид.
6. Концентрированная серная кислота.

Для исследования необходима сыворотка крови.

Техника определения

В штатив устанавливают две градуированные центрифужные пробирки и нумеруют их. В обе пробирки наливают по 3,8 мл реактива Блюра. Микропипеткой в каждую пробирку доливают по 0,2 мл исследуемой сыворотки и тщательно перемешивают их содержимое стеклянной палочкой. Пробирки плотно закрывают резиновыми пробками в амальгаме и оставляют на 24 часа при комнатной температуре.

Через сутки пробирки открывают и содержимое их вновь перемешивают. Если объем жидкости меньше 4 мл (из-за летучести хлороформа), его доводят реактивом Блюра до первоначального объема — 4 мл. Пробирки можно не закрывать пробками, а сразу же после смешения исследуемой сыворотки с реактивом Блюра погрузить в кипящую водяную баню на 25-35 секунд, размешивая при этом их содержимое стеклянной палочкой.

Пробирки центрифугируют в течение 5 минут при 1000-1500 об/мин. В штатив устанавливают две «сахарные» пробирки и нумеруют их. В каждую из них наливают по 2 мл центрифугата и ставят на водяную баню до полного выпаривания жидкости, в результате чего на дне пробирок образуется пленочка.

Вынув пробирки из водяной бани, их устанавливают в штатив, добавляют для контроля третью сахарную пробирку и в каждую из них разливают реактивы в такой последовательности:

Содержимое пробирок взбалтывают и ставят на 15-20 минут в темноту. За это время возникает зеленое окрашивание, интенсивность которого пропорциональна содержанию холестерина.

Определение концентрации холестерина проводят в колориметре Дюбоска или КОЛ-1. Пример расчета:

Сх=0.2X20X100/(15X0,1)=266,6 мг%

где 0,2 — концентрация холестерина в 2 мл рабочего стандартного раствора в миллиграммах; 20 — толщина слоя рабочего стандарного раствора холестерина; 15 — толщина слоя исследуемого раствора; 100 — коэффициент перевода в миллиграмм-проценты; 0,1 —количество сыворотки, в котором определяют холестерин.

Определение холестерина в крови по методу Мрскоса и Товарека

Сущность метода та же, что и метода Блюра. Для этого метода необходимы следующие реактивы:

1. 12% раствор сульфосалициловой кислоты: 12 г сульфосалициловой кислоты помещают в мерную колбочку на 100 мл, растворяют в 60-70 мл ледяной уксусной кислоты и доливают ледяной уксусной кислотой до метки.
2. Ледяная уксусная кислота.
3. Уксусный ангидрид.
4. Концентрированная серная кислота.

Для исследования нужна сыворотка крови.

Техника определения

В штатив устанавливают три нумерованные центрифужные пробирки. В первые две (опытные) и в третью (контрольную) разливают реактивы в такой последовательности:

После добавления всех реактивов содержимое пробирок разогревается, поэтому им дают остыть, а затем в каждую из них наливают по 0,4 мл концентрированной сорной кислоты и энергично смешивают их содержимое до тех пор, пока в опытных пробирках не растворится осадок из белков крови. Затем пробирки для охлаждения погружают в воду со льдом на 3-4 минуты и оставляют их на 20 минут в темном месте при комнатной температуре. За это время в них развивается зеленое окрашивание.

Определение концентрации холестерина проводят на фотоэлектроколориметре. С этой целью опытные пробы колориметрируют против контроля в кюветах с расстоянием рабочих граней 10 мм, при красном светофильтре, показания снимают с правого барабана.

Из полученных при колориметрировании экстинкций выводят среднее арифметическое, а затем по калибровочной кривой находят результат, который выражают в миллиграмм-процентах холестерина.

Можно также рассчитать результаты, умножив полученную экстинкцию на коэффициент 667 (Й. Тодоров).

Результаты исследования оформляют в бланке анализа. Содержание холестерина в норме равно 160-230 мг%.